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Lipoxigenasa

Las lipoxigenasas ( EC 1.13.11.-) ( LOX ) son una familia de enzimas que contienen hierro (no hemo ) , más específicamente enzimas oxidativas , la mayoría de las cuales catalizan la dioxigenación de ácidos grasos poliinsaturados en lípidos que contienen un cis,cis-1,4- pentadieno en agentes de señalización celular que cumplen diversas funciones como señales autocrinas que regulan la función de sus células madre, señales paracrinas que regulan la función de las células cercanas y señales endocrinas que regulan la función de las células distantes.

Las lipoxigenasas están relacionadas entre sí en función de su estructura genética similar y su actividad de dioxigenación. Sin embargo, una lipoxigenasa, ALOXE3, si bien tiene una estructura genética de lipoxigenasa, posee relativamente poca actividad de dioxigenación; más bien, su actividad principal parece ser como una isomerasa que cataliza la conversión de ácidos grasos insaturados hidroperoxi en sus derivados hidroxilados 1,5 - epóxido .

Las lipoxigenasas se encuentran en eucariotas (plantas, hongos, animales, protistas); mientras que el tercer dominio de la vida terrestre, las arqueas , posee proteínas con una ligera (~20%) similitud de secuencia de aminoácidos con las lipoxigenasas, estas proteínas carecen de residuos que se unan al hierro y, por lo tanto, no se proyecta que posean actividad lipoxigenasa. [2]

Bioquímica

Con base en análisis detallados de la 15-lipoxigenasa 1 y la 5-lipoxigenasa estabilizada, las estructuras de la lipoxigenasa consisten en un dominio de barril beta N-terminal de 15 kilodalton , un interdominio de enlace pequeño (p. ej. ~0,6 kilodalton) (ver Dominio de proteína § Dominios y flexibilidad de proteínas ) y un dominio catalítico C-terminal relativamente grande que contiene el hierro no hemo crítico para la actividad catalítica de las enzimas. [3] La mayoría de las lipoxigenasas (excepción, ALOXE3) catalizan la reacción Ácido graso poliinsaturado + O 2 → hidroperóxido de ácido graso en cuatro pasos:

El residuo (—OO − ) puede entonces ser protonado para formar un grupo hidroperóxido (—OOH) y luego metabolizado por la lipoxigenasa a, por ejemplo, leucotrienos , hepoxilinas y varios mediadores especializados de pro-resolución , o reducido por glutatión peroxidasas celulares ubicuas a un grupo hidroxi, formando así ácidos grasos poliinsaturados hidroxilados (—OH) tales como los ácidos hidroxieicosatetraenoicos y HODE (es decir, ácidos hidroxioctadecaenoicos). [3]

Los ácidos grasos poliinsaturados que sirven como sustratos para una o más de las lipoxigenasas incluyen los ácidos grasos omega 6 , ácido araquidónico , ácido linoleico , ácido dihomo-γ-linolénico y ácido adrenico ; los ácidos grasos omega-3 , ácido eicosapentaenoico , ácido docosahexaenoico y ácido alfa-linolénico ; y el ácido graso omega-9 , ácido mead . [4] Ciertos tipos de lipoxigenasas, por ejemplo, la 15-lipoxigenasa 1 humana y murina, la 12-lipoxigenasa B y la ALOXE3, son capaces de metabolizar sustratos de ácidos grasos que son constituyentes de fosfolípidos, ésteres de colesterol o lípidos complejos de la piel. [3] La mayoría de las lipoxigenasas catalizan la formación de productos hidroperoxi formados inicialmente que tienen quiralidad S. Las excepciones a esta regla incluyen las 12R-lipoxigenasas de los humanos y otros mamíferos (ver más abajo). [3] [4] [5]

Las lipoxigenasas dependen de la disponibilidad de sus sustratos de ácidos grasos poliinsaturados que, particularmente en las células de mamíferos, normalmente se mantienen en niveles extremadamente bajos. En general, varias fosfolipasas A2 y diacilglicerol lipasas se activan durante la estimulación celular, proceden a liberar estos ácidos grasos de sus sitios de almacenamiento y, por lo tanto, son reguladores clave en la formación de metabolitos dependientes de la lipoxigenasa. [3] Además, las células, cuando se activan de esta manera, pueden transferir sus ácidos grasos poliinsaturados liberados a células adyacentes o cercanas que luego los metabolizan a través de sus vías de lipoxigenasa en un proceso denominado metabolismo transcelular o biosíntesis transcelular. [6]

Función biológica y clasificación

Estas enzimas son más comunes en las plantas, donde pueden estar involucradas en varios aspectos diversos de la fisiología de la planta, incluido el crecimiento y el desarrollo, la resistencia a las plagas y la senescencia o las respuestas a las heridas. [7] En los mamíferos, varias isoenzimas de lipoxigenasas están involucradas en el metabolismo de los eicosanoides (como las prostaglandinas , los leucotrienos y los eicosanoides no clásicos ). [8] Hay datos de secuencia disponibles para las siguientes lipoxigenasas:

Lipoxigenasas vegetales

Las plantas expresan una variedad de lipoxigenasas citosólicas ( EC 1.13.11.12; InterPro :  IPR001246 ), así como lo que parece ser una isozima del cloroplasto. [9] La lipoxigenasa de las plantas junto con las liasas de hidroperóxido son responsables de muchas fragancias y otros compuestos de señalización. Un ejemplo es el cis-3-hexenal , el olor de la hierba recién cortada .

Una transformación ilustrativa que involucra una liasa de hidroperóxido. Aquí, el cis-3-hexenal se genera a partir del ácido linolénico hasta el hidroperóxido por la acción de una lipoxigenasa seguida por la liasa. [10]

Lipoxigenasas humanas

Con la excepción del gen que codifica 5-LOX ( ALOX5 ), que se encuentra en el cromosoma 10q11.2, los seis genes LOX humanos se encuentran en el cromosoma 17.p13 y codifican una proteína de cadena única de 75-81 kilodaltons que consta de 662-711 aminoácidos. Los genes LOX de mamíferos contienen 14 ( ALOX5 , ALOX12 , ALOX15 , ALOX15B ) o 15 ( ALOX12B , ALOXE3 ) exones con límites exón/ intrón en posiciones altamente conservadas. [11] [12] Las 6 lipoxigenasas humanas junto con algunos de los principales productos que producen, así como algunas de sus asociaciones con enfermedades genéticas, son las siguientes: [11] [13] [14] [15] [16]

Dos lipoxigenasas pueden actuar en serie para producir productos dihidroxi o trihidroxi que tienen actividades muy diferentes a las de las lipoxigenasas. Este metabolismo en serie puede ocurrir en diferentes tipos de células que expresan solo una de las dos lipoxigenasas en un proceso denominado metabolismo transcelular. Por ejemplo, ALOX5 y ALOX15 o, alternativamente, ALOX5 y ALOX12 pueden actuar en serie para metabolizar el ácido araquidónico en lipoxinas (ver Ácido 15-hidroxieicosatetraenoico §§  Metabolismo adicional​ y Actividades de 15(S)-HpETE, 15(S)-HETE, 15(R)-HpETE, 15(R)-HETE y 15-oxo-ETE y Lipoxina § Síntesis ) mientras que ALOX15 y posiblemente ALOX15B pueden actuar con ALOX5 para metabolizar el ácido eicosapentaenoico en resolvinas D (ver Resolvina § Bioquímica y producción ).

Lipoxigenasas de ratón

El ratón es un modelo común para examinar la función de la lipoxigenasa. Sin embargo, existen algunas diferencias clave entre las lipoxigenasas entre ratones y hombres que dificultan las extrapolaciones de los estudios con ratones a los humanos. A diferencia de las 6 lipoxigenasas funcionales en humanos, los ratones tienen 7 lipoxigenasas funcionales y algunas de estas últimas tienen actividades metabólicas diferentes a las de sus ortólogos humanos . [11] [ 19] [21] En particular, la Alox15 de ratón, a diferencia de la ALOX15 humana, metaboliza el ácido araquidónico principalmente a 12-HpETE y la Alox15b de ratón, a diferencia de la ALOX15b humana, es principalmente una 8-lipoxigenasa, que metaboliza el ácido araquidónico a 8-HpETE; no existe una lipoxigenasa formadora de 8-HpETE comparable en humanos. [22]

15-lipoxigenasa de conejo (azul) con inhibidor (amarillo) unido al sitio activo

Estructura 3D

Existen varias estructuras de lipooxigenasa conocidas, entre ellas: lipooxigenasa de soja L1 y L3, 8-lipoxigenasa de coral, 5-lipoxigenasa humana, 15-lipoxigenasa de conejo y dominio catalítico de 12-lipoxigenasa de leucocitos porcinos. La proteína consta de un pequeño dominio PLAT N-terminal y un dominio catalítico C-terminal principal (consulte la base de datos Pfam ), que contiene el sitio activo . Tanto en las enzimas vegetales como en las mamíferas, el dominio N-terminal contiene un barril β antiparalelo de ocho hebras, pero en las lipooxigenasas de soja este dominio es significativamente más grande que en la enzima de conejo. Las lipooxigenasas vegetales se pueden escindir enzimáticamente en dos fragmentos que permanecen estrechamente asociados mientras la enzima permanece activa; la separación de los dos dominios conduce a la pérdida de la actividad catalítica. El dominio C-terminal (catalítico) consta de 18-22 hélices y una (en la enzima de conejo) o dos (en las enzimas de soja) láminas β antiparalelas en el extremo opuesto del barril β N-terminal.

Sitio activo

El átomo de hierro en las lipoxigenasas está unido por cuatro ligandos, tres de los cuales son residuos de histidina. [23] Se conservan seis histidinas en todas las secuencias de lipoxigenasas, cinco de ellas se encuentran agrupadas en un tramo de 40 aminoácidos. Esta región contiene dos de los tres ligandos de zinc; se ha demostrado [24] que las otras histidinas son importantes para la actividad de las lipoxigenasas.

Las dos hélices centrales largas se cruzan en el sitio activo; ambas hélices incluyen tramos internos de hélice π que proporcionan tres ligandos de histidina (His) al hierro del sitio activo. Dos cavidades en el dominio principal de la lipoxigenasa-1 de soja (cavidades I y II) se extienden desde la superficie hasta el sitio activo. La cavidad I en forma de embudo puede funcionar como un canal de dioxígeno; la cavidad II larga y estrecha es presumiblemente un bolsillo de sustrato. La enzima mamífera más compacta contiene solo una cavidad en forma de bota (cavidad II). En la lipoxigenasa-3 de soja hay una tercera cavidad que va desde el sitio de hierro hasta la interfaz de los dominios de barril β y catalítico. La cavidad III, el sitio de hierro y la cavidad II forman un pasaje continuo a lo largo de la molécula de proteína.

El hierro del sitio activo está coordinado por el N ε de tres residuos de His conservados y un oxígeno del grupo carboxilo C-terminal. Además, en las enzimas de soja, el oxígeno de la cadena lateral de la asparagina está débilmente asociado con el hierro. En la lipoxigenasa de conejo, este residuo de Asn se reemplaza con His, que coordina el hierro a través del átomo N δ . Por lo tanto, el número de coordinación del hierro es cinco o seis, con un ligando hidroxilo o agua para un hierro hexacoordinado.

Los detalles sobre la característica del sitio activo de la lipoxigenasa se revelaron en la estructura del complejo del dominio catalítico de la lipoxigenasa 12 del leucocito porcino [23] [25] En la estructura 3D, el inhibidor del análogo del sustrato ocupaba un canal en forma de U abierto adyacente al sitio de hierro. Este canal podría acomodar el ácido araquidónico sin mucho cálculo, definiendo los detalles de unión del sustrato para la reacción de la lipoxigenasa. Además, un canal de acceso plausible, que intercepta el canal de unión del sustrato y se extiende a la superficie de la proteína, podría contarse para la ruta del oxígeno.

Clasificación bioquímica

La lipoxigenasa de soja 1 exhibe el mayor efecto isotópico cinético (KIE) H/D sobre kcat (kH/kD) (81 cerca de la temperatura ambiente) informado hasta ahora para un sistema biológico. Recientemente, se encontró un KIE extremadamente elevado de 540 a 730 en una lipoxigenasa de soja 1 mutante doble. [26] Debido a la gran magnitud del KIE, la lipoxigenasa de soja 1 ha servido como prototipo para reacciones de tunelización de hidrógeno catalizadas por enzimas.

Las proteínas humanas expresadas de la familia de la lipoxigenasa incluyen ALOX12 , ALOX12B , ALOX15 , ALOX15B , ALOX5 y ALOXE3 . Si bien los humanos también poseen el gen ALOX12P2 , que es un ortólogo del gen Alox12P bien expresado en ratones, el gen humano es un pseudogén ; en consecuencia, la proteína ALOX12P2 no se detecta en humanos. [27]

Referencias

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