Las dioxigenasas son enzimas oxidorreductasas . La vida aeróbica , desde las simples especies de bacterias unicelulares hasta los complejos organismos eucariotas , ha evolucionado para depender del poder oxidante del dioxígeno en varias vías metabólicas. Desde la generación energética de trifosfato de adenosina (ATP) hasta la degradación de xenobióticos , el uso del dioxígeno como oxidante biológico está muy extendido y varía en el mecanismo exacto de su uso. Las enzimas emplean muchos esquemas diferentes para utilizar el dioxígeno, y esto depende en gran medida del sustrato y la reacción en cuestión.
En las monooxigenasas , solo se incorpora un único átomo de dioxígeno a un sustrato y el otro se reduce a una molécula de agua. Las dioxigenasas ( EC 1.13.11) catalizan la oxidación de un sustrato sin la reducción de un átomo de oxígeno del dioxígeno a una molécula de agua. Sin embargo, esta definición es ambigua porque no tiene en cuenta cuántos sustratos están involucrados en la reacción. La mayoría de las dioxígenasas incorporan completamente el dioxígeno en un solo sustrato y se utilizan diversos esquemas de cofactores para lograrlo. Por ejemplo, en las enzimas dependientes de α-cetoglutarato , se incorpora un átomo de dioxígeno a dos sustratos, siendo uno siempre α-cetoglutarato, y esta reacción es provocada por un centro de hierro mononuclear.
El cofactor más ampliamente observado que interviene en las reacciones de dioxigenación es el hierro , pero el esquema catalítico empleado por estas enzimas que contienen hierro es muy diverso. Las dioxigenasas que contienen hierro se pueden subdividir en tres clases en función de cómo se incorpora el hierro al sitio activo: las que emplean un centro de hierro mononuclear, las que contienen un grupo Rieske [2Fe-2S] y las que utilizan un grupo prostético hemo .
Las dioxigenasas de hierro mononucleares, o dioxigenasas dependientes de hierro no hemo , como también se las denomina, utilizan un solo hierro catalítico para incorporar uno o ambos átomos de dioxígeno en un sustrato. A pesar de este evento de oxigenación común, las dioxigenasas de hierro mononucleares son diversas en la forma en que se utiliza la activación del dioxígeno para promover ciertas reacciones químicas. [1] Por ejemplo, la ruptura del enlace carbono-carbono, la hidroperoxidación de ácidos grasos, la ruptura del enlace carbono-azufre y la oxidación del tiol son todas reacciones catalizadas por dioxigenasas de hierro mononucleares. [1] [2] [3]
La mayoría de las dioxigenasas de hierro mononucleares son miembros de la superfamilia de las cupinas , en la que la estructura general del dominio se describe como un pliegue de barril β de seis cadenas (o motivo de rollo de gelatina ). En el centro de esta estructura de barril hay un ion metálico, más comúnmente hierro ferroso, cuyo entorno de coordinación es proporcionado con frecuencia por residuos en dos motivos estructurales parcialmente conservados: G(X) 5 HXH(X) 3 - 4 E(X) 6 G y G(X) 5 - 7 PXG(X) 2 H(X) 3 N. [4] [5]
Dos grupos importantes de dioxigenasas de hierro mononucleares no hemo son las dioxigenasas de catecol y las dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato (2OG) . [6] Las dioxigenasas de catecol , algunas de las enzimas dioxigenasas mejor estudiadas, utilizan dioxígeno para escindir un enlace carbono-carbono de un sistema de anillo de catecol aromático. [4] Las dioxigenasas de catecol se clasifican además como "extradiol" o "intradiol", y esta distinción se basa en diferencias mecanísticas en las reacciones (figuras 1 y 2). Las enzimas intradiol escinden el enlace carbono-carbono entre los dos grupos hidroxilo. El centro férrico activo está coordinado por cuatro ligandos proteicos (dos residuos de histidina y dos de tirosinato ) de manera bipiramidal trigonal con una molécula de agua ocupando el quinto sitio de coordinación. [3] Una vez que un sustrato de catecolato se une al centro metálico de manera bidentada a través de los grupos hidroxilo desprotonados, el hierro férrico “activa” el sustrato mediante la abstracción de un electrón para producir un radical en el sustrato. Esto permite que se produzca la reacción con el dioxígeno y la posterior escisión intradiol a través de un intermedio de anhídrido cíclico. [2] [4] Los miembros extradiol utilizan hierro ferroso como estado redox activo, y este centro está comúnmente coordinado octaédricamente a través de un motivo 2-His-1-Glu con ligandos de agua lábiles que ocupan posiciones vacías. Una vez que un sustrato se une al centro ferroso, esto promueve la unión del dioxígeno y la posterior activación. [2] [4] [7] Esta especie de oxígeno activado luego procede a reaccionar con el sustrato, escindiendo finalmente el enlace carbono-carbono adyacente a los grupos hidroxilo a través de la formación de un intermedio de α-cetolactona. [3]
En las dioxigenasas dependientes de 2OG, el hierro ferroso ( Fe(II) ) también está coordinado por un motivo de "tríada facial" (His)2(Glu/Asp)1. La coordinación bidentada de 2OG y agua completa una esfera de coordinación pseudooctaédrica. Después de la unión del sustrato, se libera el ligando de agua, lo que produce un sitio de coordinación abierto para la activación del oxígeno. [6] Tras la unión del oxígeno, se produce una transformación poco comprendida durante la cual 2OG se descarboxila oxidativamente a succinato y el enlace OO se escinde para formar un intermedio Fe(IV)-oxo ( ferril ). Este potente oxidante se utiliza luego para llevar a cabo varias reacciones, incluidas la hidroxilación, la halogenación y la desmetilación. [8] En el caso mejor caracterizado, las hidroxilasas, el intermedio ferryl abstrae un átomo de hidrógeno de la posición objetivo del sustrato, lo que produce un radical de sustrato y Fe(III)-OH. Este radical luego se acopla al ligando hidróxido, produciendo el producto hidroxilado y el estado de reposo Fe(II) de la enzima. [8]
Las dioxigenasas de Rieske catalizan habitualmente la cis-dihidroxilación de arenos a productos cis-dihidro-diol. Estas dioxigenasas también catalizan la sulfoxidación, la desaturación y la oxidación bencílica. [2] Estas enzimas se encuentran de forma destacada en bacterias del suelo como Pseudomonas , [3] y sus reacciones constituyen el paso inicial en la biodegradación de hidrocarburos aromáticos. [2] Las dioxigenasas de Rieske son estructuralmente más complejas que otras dioxigenasas debido a la necesidad de una vía de transferencia de electrones eficiente (figura 2) para mediar la reducción adicional y simultánea de dos electrones del sustrato aromático.
Las dioxigenasas de Rieske tienen tres componentes: una FAD reductasa dependiente de NADH , una ferredoxina con dos grupos de Rieske [2Fe-2S] y una oxigenasa α3β3 con cada subunidad α que contiene un centro de hierro mononuclear y un grupo de Rieske [2Fe-2S]. [2] Dentro de cada subunidad α, el grupo de hierro-azufre y el centro de hierro mononuclear están separados por una distancia de ~43 Å, demasiado lejos para una transferencia de electrones eficiente . En cambio, se propone que la transferencia de electrones está mediada por estos dos centros en subunidades adyacentes, que el grupo de hierro-azufre de una subunidad transfiere electrones al centro de hierro mononuclear de la subunidad adyacente que está convenientemente separado por ~12 Å. Si bien esta distancia parecería óptima para una transferencia eficiente de electrones, el reemplazo del residuo de aspartato puente provoca una pérdida de la función enzimática, lo que sugiere que la transferencia de electrones en cambio se realiza a través de la red de enlaces de hidrógeno que se mantiene en su lugar gracias a este residuo de aspartato. [3]
Se ha descrito el mecanismo de activación del O2 por esta clase de dioxigenasas. [7] Esta especie podría representar el oxidante activo, o podría sufrir una escisión hemolítica del enlace OO para producir un intermediario de hierro(V)-oxo como agente oxidante activo. [3] [7]
Aunque la mayoría de las dioxigenasas dependientes de hierro utilizan un cofactor de hierro no hemo, la oxidación de L-(y D-)triptófano a N-formilquinurenina es catalizada por la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) o la indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), que son dioxigenasas hemo que utilizan hierro coordinado por un grupo prostético hemo B. [9] [10] Aunque estas dioxigenasas son de interés en parte porque utilizan exclusivamente el hemo para la catálisis, también son de interés debido a su importancia en la regulación del triptófano en la célula, lo que tiene numerosas implicaciones fisiológicas. [11] Se cree que la asociación inicial del sustrato con el dioxígeno-hierro en el sitio activo de la enzima procede ya sea por adición radical o electrofílica, requiriendo hierro ferroso o hierro férrico, respectivamente. [9] Aunque el mecanismo de reacción exacto de las dioxigenasas dependientes del hemo aún está en debate, se postula que la reacción se lleva a cabo a través de un mecanismo de dioxetano o de Criegee (figuras 4, 5). [9] [11]
Si bien el hierro es, con mucho, el cofactor más frecuente utilizado para la dioxigenación enzimática, no todas las dioxigenasas lo requieren para la catálisis. La quercetina 2,3-dioxigenasa (quercetinasa, QueD) cataliza la escisión dioxígenolítica de la quercetina a ácido 2-protocatechuoylfloroglucinolcarboxílico y monóxido de carbono . [12] La enzima más caracterizada, de Aspergillus japonicus , requiere la presencia de cobre , [4] y se ha descubierto quercetinasas bacterianas que son bastante promiscuas (cambialísticas) [13] en sus requisitos de un centro metálico, con diversos grados de actividad informados con la sustitución de manganeso divalente , cobalto , hierro, níquel y cobre. [12] (Quercetina, papel en el metabolismo). La acireductona (1,2-dihidroxi-5-(metiltio)pent-1-en-3-ona) dioxigenasa (ARD) se encuentra tanto en procariotas como en eucariotas . [4] [12] [14] Las enzimas ARD de la mayoría de las especies se unen al hierro ferroso y catalizan la oxidación de la acireductona a 4-(metiltio)-2-oxobutanoato, el α-cetoácido de la metionina , y ácido fórmico . Sin embargo, la ARD de Klebsiella oxytoca cataliza una reacción adicional cuando se une el níquel(II): en su lugar, produce 3-(metiltio)propionato, formato y monóxido de carbono a partir de la reacción de la acireductona con dioxígeno. La actividad de Fe-ARD está estrechamente entrelazada con la vía de recuperación de metionina, en la que el producto de metiltioadenosina de las reacciones celulares de S-adenosil metionina (SAM) finalmente se convierte en acireductona.
Si bien no se conoce el papel exacto de Ni-ARD, se sospecha que ayuda a regular los niveles de metionina al actuar como una derivación en la vía de salvamento. Esta enzima de K. oxytoca representa un ejemplo único en el que el ion metálico presente dicta qué reacción se cataliza. Las quercetinasas y las enzimas ARD son todas miembros de la superfamilia cupina , a la que también pertenecen las enzimas de hierro mononuclear. [15] El esquema de coordinación de metales para las enzimas QueD es 3-His o 3-His-1-Glu y la disposición exacta es específica del organismo. [4] Todas las enzimas ARD quelan el metal catalítico (Ni o Fe) a través del motivo 3-His-1-Glu. [15] En estas dioxigenasas, los ligandos de coordinación son proporcionados por ambos motivos típicos de cupina. En las enzimas ARD, el metal existe en una disposición octaédrica con los tres residuos de histidina que comprenden una tríada facial. [14] Los centros metálicos de la quercetinasa bacteriana suelen tener un entorno de coordinación bipiramidal trigonal u octaédrico cuando hay cuatro ligandos proteicos; los centros metálicos de las enzimas QueD dependientes del cobre poseen una geometría tetraédrica distorsionada en la que solo los tres residuos de histidina conservados proporcionan ligandos de coordinación. [4] [12] Los sitios de coordinación vacíos en todos los centros metálicos están ocupados por ligandos de agua hasta que estos son desplazados por el sustrato entrante.
La capacidad de estas dioxigenasas de mantener su actividad en presencia de otros cofactores metálicos con amplios rangos de potenciales redox sugiere que el centro metálico no desempeña un papel activo en la activación del dioxígeno. Más bien, se piensa que el centro metálico funciona para mantener el sustrato en la geometría adecuada para que reaccione con el dioxígeno. En este sentido, estas enzimas recuerdan a las intradiol catecol dioxigenasas , en las que los centros metálicos activan el sustrato para la reacción posterior con el dioxígeno.
Las dioxigenasas que catalizan reacciones sin la necesidad de un cofactor son mucho más raras en la naturaleza que aquellas que sí los requieren. Se ha demostrado que dos dioxigenasas, la 1H-3-hidroxi-4-oxo-quinolina 2,4-dioxigenasa (QDO) y la 1H-3-hidroxi-4-oxoquinaldina 2,4-dioxigenasa (HDO), no requieren ni un cofactor orgánico ni metálico. [16] Estas enzimas catalizan la degradación de heterociclos de quinolona de una manera similar a la quercetina dioxigenasa , pero se cree que median una reacción radical de una molécula de dioxígeno con un carbanión en el sustrato (figura 5). [17] Tanto la HDO como la QDO pertenecen a la superfamilia de enzimas α/β hidrolasa , aunque los residuos catalíticos en la HDO y la QDO no parecen cumplir la misma función que en el resto de las enzimas de la superfamilia α/β hidrolasa. [16]
La diversidad en la familia de las dioxigenasas significa una amplia gama de funciones biológicas:
