La terapia génica de la retina es prometedora en el tratamiento de diferentes formas de ceguera hereditaria y no hereditaria .
En 2008, tres grupos de investigación independientes informaron que pacientes con amaurosis congénita de Leber, una enfermedad genética poco común de la retina , habían sido tratados con éxito mediante terapia génica con virus adenoasociado (AAV). [1] [2] [3] En los tres estudios, se utilizó un vector AAV para administrar una copia funcional del gen RPE65, que restauró la visión en niños que sufrían de LCA. Estos resultados fueron vistos ampliamente como un éxito en el campo de la terapia génica y han generado entusiasmo e impulso para las aplicaciones mediadas por AAV en enfermedades de la retina.
En la terapia génica de la retina, los vectores más utilizados para la administración de genes oculares se basan en virus adenoasociados . La gran ventaja de utilizar virus adenoasociados para la terapia génica es que plantea respuestas inmunitarias mínimas y media la expresión transgénica a largo plazo en una variedad de tipos de células de la retina. Por ejemplo, las uniones estrechas que forman la barrera hematorretiniana separan el espacio subretinal del suministro de sangre , proporcionando protección contra los microbios y disminuyendo la mayoría de los daños mediados por el sistema inmunitario. [4]
Aún falta mucho conocimiento sobre las distrofias de retina. Se necesita una caracterización detallada para mejorar el conocimiento. Para abordar este problema, la creación de registros es un intento de agrupar y caracterizar las enfermedades raras. Los registros ayudan a localizar y medir todos los fenotipos de estas afecciones y, por lo tanto, brindan un seguimiento fácil y brindan una fuente de información a la comunidad científica. Los diseños de los registros varían de una región a otra, sin embargo, la localización y caracterización del fenotipo son el estándar de oro. Algunos ejemplos de registros son: RetMxMap<ARVO 2009>. Un registro mexicano y latinoamericano creado desde 2009. Este registro fue creado por la Dra. Adda Lízbeth Villanueva Avilés. Ella es una científica clínica que mapea genes de distrofias de retina hereditarias en México y otros países latinoamericanos.
En 1996 se publicaron estudios preclínicos en modelos de ratón de amaurosis congénita de Leber (LCA) y en 2001 se publicó un estudio en perros. En 2008, tres grupos informaron los resultados de ensayos clínicos en los que se utilizó un virus adenoasociado para la LCA. En estos estudios, se administró un vector AAV que codifica el gen RPE65 mediante una "inyección subretinal", en la que se inyecta una pequeña cantidad de líquido debajo de la retina en un breve procedimiento quirúrgico. [5] El desarrollo continuó y, en diciembre de 2017, la FDA aprobó Voretigene neparvovec (Luxturna), una terapia génica basada en un vector de virus adenoasociado para niños y adultos con mutaciones bialélicas del gen RPE65 responsables de la distrofia retiniana, incluida la amaurosis congénita de Leber. Las personas deben tener células retinianas viables como requisito previo para la administración intraocular del fármaco. [6]
Tras el éxito de los ensayos clínicos en LCA, los investigadores han estado desarrollando tratamientos similares utilizando virus adenoasociados para la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE). Hasta la fecha, los esfuerzos se han centrado en la administración a largo plazo de inhibidores del VEGF para tratar la forma húmeda de la degeneración macular. Mientras que la DMRE húmeda se trata actualmente con inyecciones frecuentes de proteína recombinante en el globo ocular, el objetivo de estos tratamientos es el control de la enfermedad a largo plazo después de una única administración. Uno de estos estudios se está llevando a cabo en el Lions Eye Institute en Australia [7] en colaboración con Avalanche Biotechnologies, una empresa emergente de biotecnología con sede en EE. UU. Otro estudio en fase inicial está patrocinado por Genzyme Corporation . [8]
En octubre de 2011 se anunció el primer ensayo clínico para el tratamiento de la coroideremia . [9] El Dr. Robert MacLaren de la Universidad de Oxford, que dirigió el ensayo, co-desarrolló el tratamiento con el Dr. Miguel Seabra del Imperial College de Londres. Este ensayo de fase 1/2 utilizó AAV subretinal para restaurar el gen REP en pacientes afectados. [10] Los resultados iniciales del ensayo se informaron en enero de 2014 como prometedores ya que los seis pacientes tuvieron una mejor visión. [11] [12]
Investigaciones recientes han demostrado que el AAV puede restaurar con éxito la visión del color para tratar el daltonismo en monos adultos. [13] Aunque este tratamiento aún no ha entrado en ensayos clínicos para humanos, este trabajo se consideró un gran avance por la capacidad de dirigirse a los fotorreceptores de cono. [14]
La retina neural de los vertebrados está compuesta por varias capas y distintos tipos de células (véase anatomía de la retina humana ). Varios de estos tipos de células están implicados en enfermedades de la retina, incluidas las células ganglionares de la retina , que se degeneran en el glaucoma, los fotorreceptores de conos y bastones , que responden a la luz y se degeneran en la retinosis pigmentaria , la degeneración macular y otras enfermedades de la retina, y el epitelio pigmentario de la retina (EPR), que sostiene a los fotorreceptores y también está implicado en la retinosis pigmentaria y la degeneración macular .
En la terapia génica de la retina , el AAV es capaz de "transducir" estos diversos tipos de células al ingresar en ellas y expresar la secuencia terapéutica de ADN. Dado que las células de la retina no se dividen, el AAV continúa persistiendo y brindando expresión de la secuencia terapéutica de ADN durante un largo período de tiempo que puede durar varios años. [15]
El AAV es capaz de transducir múltiples tipos de células dentro de la retina. El serotipo 2 del AAV, el tipo de AAV más estudiado, se administra comúnmente en una de dos vías: intravítrea o subretinal. Utilizando la vía intravítrea, el AAV se inyecta en el humor vítreo del ojo. Utilizando la vía subretinal, el AAV se inyecta debajo de la retina, aprovechando el espacio potencial entre los fotorreceptores y la capa del epitelio pigmentario de la retina, en un procedimiento quirúrgico corto. Aunque esto es más invasivo que la vía intravítrea, el fluido es absorbido por el epitelio pigmentario de la retina y la retina se aplana en menos de 14 horas sin complicaciones. [1] El AAV intravítreo se dirige a las células ganglionares de la retina y algunas células gliales de Müller. El AAV subretinal se dirige eficazmente a los fotorreceptores y las células del epitelio pigmentario de la retina. [16] [17]
La razón por la que diferentes vías de administración conducen a la transfección de diferentes tipos de células (por ejemplo, diferente tropismo ) es que la membrana limitante interna (ILM) y las diversas capas de la retina actúan como barreras físicas para la administración de fármacos y vectores a las capas más profundas de la retina. [18] Por lo tanto, en general, el AAV subretinal es de 5 a 10 veces más eficiente que la administración mediante la vía intravítrea.
Un factor importante en la transferencia de genes es el desarrollo de tropismos celulares alterados para reducir o ampliar la transferencia de genes mediada por rAAV y aumentar su eficiencia en los tejidos. Propiedades específicas como la conformación de la cápside y las estrategias de selección de células pueden determinar qué tipos de células se ven afectadas y también la eficiencia del proceso de transferencia de genes . Se pueden realizar diferentes tipos de modificaciones. Por ejemplo, la modificación mediante cambios químicos, inmunológicos o genéticos que permiten que la cápside de AAV2 interactúe con moléculas específicas de la superficie celular . [19]
Los estudios iniciales con AAV en la retina han utilizado el serotipo 2 de AAV. Ahora los investigadores están empezando a desarrollar nuevas variantes de AAV, basadas en serotipos de AAV naturales y variantes de AAV diseñadas. [20]
Se han aislado varios serotipos naturales de AAV que pueden transducir células retinianas. Tras la inyección intravítrea, solo los serotipos 2 y 8 de AAV fueron capaces de transducir células ganglionares retinianas. Ocasionalmente, los serotipos 2, 8 y 9 de AAV transdujeron células de Müller. Tras la inyección subretinal, los serotipos 2, 5, 7 y 8 transdujeron eficazmente los fotorreceptores, y los serotipos 1, 2, 5, 7, 8 y 9 transdujeron eficazmente las células del epitelio pigmentario de la retina. [17]
Recientemente se ha descrito un ejemplo de una variante diseñada que transduce eficazmente la glía de Müller después de una inyección intravítrea, y se ha utilizado para rescatar un modelo animal de retinitis pigmentosa autosómica dominante agresiva . [21] [22]
Es importante destacar que la retina tiene un sistema inmunológico privilegiado y, por lo tanto, no experimenta una inflamación o respuesta inmunitaria significativa cuando se inyecta AAV. [23] La respuesta inmunitaria a los vectores de terapia génica es lo que ha provocado el fracaso de los intentos anteriores de terapia génica y se considera una ventaja clave de la terapia génica en el ojo. La readministración ha tenido éxito en animales grandes, lo que indica que no se genera una respuesta inmunitaria duradera. [24]
Datos recientes indican que la vía subretinal puede estar sujeta a un mayor grado de privilegio inmunológico en comparación con la vía intravítrea. [25]
La expresión en varios tipos de células de la retina se puede determinar mediante la secuencia promotora. Para restringir la expresión a un tipo de célula específico, se puede utilizar un promotor específico del tejido o del tipo de célula.
Por ejemplo, en ratas, el gen de rodopsina murina impulsa la expresión en AAV2, el producto reportero GFP se encontró solo en fotorreceptores de rata, no en ningún otro tipo de célula de la retina o en el epitelio pigmentario retroperitoneal adyacente después de la inyección subretinal. Por otro lado, si se expresa de forma ubicua, el promotor-potenciador inmediato-temprano del citomegalovirus (CMV) se expresa en una amplia variedad de tipos de células transfectadas. Otros promotores ubicuos, como el promotor CBA, una fusión del promotor de actina de pollo y el potenciador inmediato-temprano del CMV, permiten la expresión estable del reportero GFP tanto en el epitelio pigmentario retroperitoneal como en las células fotorreceptoras después de las inyecciones subretinal. [26]
A veces, puede ser necesaria la modulación de la expresión transgénica, ya que la fuerte expresión constitutiva de un gen terapéutico en los tejidos de la retina podría ser perjudicial para la función retiniana a largo plazo. Se han utilizado diferentes métodos para la modulación de la expresión. Una forma es utilizar un sistema promotor regulable exógenamente en vectores AAV. Por ejemplo, el sistema de expresión inducible por tetraciclina utiliza un vector AAV2 silenciador/transactivador y una coinyección independiente inducible sensible a la doxiciclina. [26] [27] Cuando la inducción se produce mediante doxiciclina oral , este sistema muestra una regulación estricta de la expresión génica tanto en las células fotorreceptoras como en las células del epitelio pigmentario de la retina.
Un estudio realizado por el Royal College of Surgeons (RCS) en un modelo de rata muestra que una mutación recesiva en un gen de la tirosina quinasa del receptor, mertk, da como resultado un codón de parada prematuro y una función de fagocitosis deteriorada por las células del epitelio pigmentario de la retina. Esta mutación causa la acumulación de restos del segmento externo en el espacio subretinal, lo que causa la muerte de las células fotorreceptoras. El organismo modelo con esta enfermedad recibió una inyección subretinal de AAV serotipo 2 que llevaba un ADNc de Mertk de ratón bajo el control de los promotores CMV o RPE65. Se descubrió que este tratamiento prolongaba la supervivencia de las células fotorreceptoras durante varios meses [28] y también el número de fotorreceptores era 2,5 veces mayor en los ojos tratados con AAV-Mertk en comparación con los controles 9 semanas después de la inyección, también encontraron una cantidad reducida de restos en el espacio subretinal.
La proteína RPE65 se utiliza en el ciclo retinoide, donde el retinol all-trans dentro del segmento externo del bastón se isomeriza a su forma 11-cis y se oxida a 11-cis retinal antes de regresar al fotorreceptor y unirse con la molécula de opsina para formar rodopsina funcional . [29] En el modelo animal knock out (RPE65-/-), el experimento de transferencia genética muestra que la administración intraocular temprana del vector RPE65 humano en el día embrionario 14 muestra una transducción eficiente del epitelio pigmentario de la retina en los ratones knock out RPE65-/- y rescata las funciones visuales. Esto demuestra que la terapia génica exitosa se puede atribuir a la administración intraocular temprana al animal enfermo.
La retinosquisis juvenil es una enfermedad que afecta el tejido nervioso del ojo. Se trata de una enfermedad degenerativa recesiva ligada al cromosoma X de la región central de la mácula y es causada por una mutación en el gen RSI que codifica la proteína retinosquisis. La retinosquisis se produce en las células fotorreceptoras y bipolares y es fundamental para mantener la integridad sináptica de la retina. [26]
En concreto, el vector AAV 5 que contiene el ADNc de RSI humano de tipo salvaje impulsado por un promotor de opsina de ratón mostró una recuperación funcional y estructural de la retina a largo plazo. Además, la fiabilidad estructural de la retina mejoró considerablemente después del tratamiento, caracterizado por un aumento del espesor de la capa nuclear externa . [26]
La retinitis pigmentosa es una enfermedad hereditaria que provoca ceguera nocturna progresiva y pérdida de la visión periférica como resultado de la muerte de las células fotorreceptoras. [26] [30] [31] La mayoría de las personas que padecen RP nacen con células bastón muertas o disfuncionales, por lo que son efectivamente ciegas durante la noche, ya que estas son las células responsables de la visión en niveles bajos de luz. Lo que sigue a menudo es la muerte de las células cono , responsables de la visión del color y la agudeza, en niveles de luz presentes durante el día. La pérdida de conos conduce a una ceguera total a partir de los cinco años de edad, pero puede no aparecer hasta muchos años después. Ha habido múltiples hipótesis sobre cómo la falta de células bastón puede conducir a la muerte de las células cono. Identificar un mecanismo para la RP es difícil porque hay más de 39 loci genéticos y genes correlacionados con esta enfermedad. En un esfuerzo por encontrar la causa de la RP, se han aplicado diferentes técnicas de terapia génica para abordar cada una de las hipótesis. [32]
Diferentes tipos de herencia pueden atribuirse a esta enfermedad: autosómica recesiva, autosómica dominante, ligada al cromosoma X, etc. La función principal de la rodopsina es iniciar la cascada de fototransducción . Las proteínas opsinas se producen en los segmentos internos de los fotorreceptores, luego se transportan al segmento externo y finalmente son fagocitadas por las células del epitelio pigmentario de la retina. Cuando ocurren mutaciones en la rodopsina, el movimiento direccional de la proteína se ve afectado porque las mutaciones pueden afectar el plegamiento de la proteína , la estabilidad y el tráfico intracelular. Un enfoque es introducir ribozimas administradas por AAV diseñadas para dirigirse y destruir un ARNm mutante. [26]
El funcionamiento de este sistema se demostró en un modelo animal que tiene un gen de rodopsina mutante. Las ribozimas AAV inyectadas se optimizaron in vitro y se utilizaron para escindir la transcripción de ARNm mutante de P23H (donde se producen la mayoría de las mutaciones) in vivo. [26]
Otra mutación en la proteína estructural rodopsina, específicamente la periferina 2, que es una glicoproteína de membrana involucrada en la formación del disco del segmento externo del fotorreceptor, puede conducir a RP recesiva y degeneración macular en humanos [30] (19). En un experimento con ratones, se administró a los ratones AAV2 que portaba un gen de periferina 2 de tipo salvaje impulsado por un promotor de rodopsina mediante inyección subretinal. El resultado mostró una mejora en la estructura y función del fotorreceptor que se detectó mediante ERG (electrorretinograma). También se detectó periferina 2 en la capa del segmento externo de la retina 2 semanas después de la inyección y se notaron efectos terapéuticos tan pronto como 3 semanas después de la inyección. Un segmento externo bien definido que contenía periferina 2 y rodopsina estaba presente 9 meses después de la inyección. [26]
Dado que la apoptosis puede ser la causa de la muerte de los fotorreceptores en la mayoría de las distrofias de la retina, se sabe que los factores de supervivencia y los reactivos antiapoptoicos pueden ser un tratamiento alternativo si la mutación es desconocida para la terapia de reemplazo genético. Algunos científicos han experimentado con el tratamiento de este problema inyectando factores tróficos sustitutos en el ojo. Un grupo de investigadores inyectó la proteína del factor de viabilidad de los conos derivado de bastones (RdCVF) (codificada por el gen Nxnl1 (Txnl6)) en el ojo de los modelos de rata con mutación dominante de RP más común. Este tratamiento demostró éxito en la promoción de la supervivencia de la actividad de los conos, pero el tratamiento sirvió incluso más significativamente para prevenir la progresión de la enfermedad al aumentar la función real de los conos. [33] También se llevaron a cabo experimentos para estudiar si el suministro de vectores AAV2 con ADNc para el factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales (GDNF) puede tener un efecto antiapoptosis en las células bastón . [26] [34] Al observar un modelo animal, el transgén de opsina contiene una proteína truncada que carece de los últimos 15 aminoácidos del extremo C, lo que provoca una alteración en el transporte de rodopsina al segmento externo y conduce a la degeneración de la retina. [26] Cuando se administra el vector AAV2-CBA-GDNF al espacio subretinal, los fotorreceptores se estabilizan y los fotorreceptores de bastón aumentan y esto se observó en la función mejorada del análisis ERG. [34] También se han llevado a cabo experimentos exitosos en animales utilizando el factor neurotrófico ciliar (CNTF), y el CNTF se está utilizando actualmente como tratamiento en ensayos clínicos humanos. [35]
La neovascularización ocular (NV) es la formación anormal de nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos ya existentes en el ojo, y es una característica de enfermedades oculares como la retinopatía diabética (RD), la retinopatía del prematuro (ROP) y la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE) (forma húmeda). Uno de los principales factores de estas enfermedades es el VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), que se sabe que induce la fuga de los vasos sanguíneos y que también es conocido por ser angiogénico. [26] En los tejidos normales, el VEGF estimula la proliferación de células endoteliales de una manera dependiente de la dosis, pero dicha actividad se pierde con otros factores angiogénicos. [36]
Se ha demostrado que muchos factores angiostáticos contrarrestan el efecto del aumento del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) local. Se ha demostrado que la forma natural de Flt-1 soluble revierte la neovascularización en ratas, ratones y monos. [37] [38] [39] [40]
El factor derivado del epitelio pigmentario ( PEDF ) también actúa como un inhibidor de la angiogénesis . La secreción de PEDF disminuye notablemente en condiciones hipóxicas, lo que permite que domine la actividad mitogénica endotelial del VEGF, lo que sugiere que la pérdida de PEDF desempeña un papel central en el desarrollo de NV impulsada por isquemia . Un hallazgo clínico muestra que los niveles de PEDF en el humor acuoso de los humanos disminuyen con el aumento de la edad, lo que indica que la reducción puede conducir al desarrollo de DMAE. [26] [41] En un modelo animal, un AAV con ADNc de PEDF humano bajo el control del promotor CMV previno NV coroidea y retiniana [42] ( 24).
El hallazgo sugiere que la expresión de factores angiostáticos mediada por AAV se puede implementar para tratar la NV. [43] [44] Este enfoque podría ser útil como una alternativa a las inyecciones frecuentes de proteína recombinante en el ojo. Además, PEDF y sFlt-1 pueden difundirse a través del tejido de la esclerótica , [45] lo que permite el potencial de ser relativamente independiente del sitio de administración intraocular.
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