La secretomática es un tipo de proteómica que implica el análisis del secretoma (todas las proteínas secretadas de una célula, tejido u organismo). [1] Las proteínas secretadas están involucradas en una variedad de procesos fisiológicos, incluyendo la señalización celular y la remodelación de la matriz , pero también son parte integral de la invasión y metástasis de células malignas . [2] Por lo tanto, la secretomática ha sido especialmente importante en el descubrimiento de biomarcadores para el cáncer [3] y la comprensión de la base molecular de la patogénesis. [4] [5] El análisis de la fracción insoluble del secretoma (la matriz extracelular ) se ha denominado matrisómica. [6]
En 2000, Tjalsma et al. acuñaron el término "secretoma" en su estudio de la eubacteria B. subtilis . Definieron el secretoma como todas las proteínas secretadas y la maquinaria secretora de las bacterias. Utilizando una base de datos de secuencias de proteínas en B. subtilis y un algoritmo que analizaba los sitios de escisión y los péptidos señal amino-terminales característicos de las proteínas secretadas, pudieron predecir qué fracción del proteoma es secretada por la célula. [7] En 2001, el mismo laboratorio estableció un estándar de secretómica: las predicciones basadas solo en la secuencia de aminoácidos no son suficientes para definir el secretoma. Utilizaron electroforesis en gel bidimensional y espectrometría de masas para identificar 82 proteínas secretadas por B. subtilis , de las cuales solo 48 se habían predicho utilizando el método basado en el genoma de su artículo anterior. [8] Esto demuestra la necesidad de verificación de proteínas de los hallazgos predichos.
A medida que se reveló la naturaleza compleja de las vías secretoras (es decir, que existen muchas vías de secreción no clásicas y muchas proteínas no secretadas que forman parte de la vía secretora clásica), se hizo necesaria una definición más detallada del secretoma. En 2010, Agrawal et al. sugirieron definir el secretoma como "el grupo global de proteínas secretadas al espacio extracelular por una célula, tejido, órgano u organismo en un momento y condiciones determinados a través de mecanismos secretores conocidos y desconocidos que involucran orgánulos secretores constitutivos y regulados". [9]
En los cultivos, las células están rodeadas de contaminantes. El suero bovino de los medios de cultivo celular y los restos celulares pueden contaminar la colección de proteínas secretadas que se utilizan para el análisis. Los contaminantes bovinos presentan un desafío particular porque las secuencias proteicas de muchas proteínas extracelulares bovinas, como la fibronectina y la fibulina-1 , son similares a las secuencias proteicas humanas. [1] Para eliminar estos contaminantes, las células se pueden lavar con PBS o medio sin suero (SFM) antes de incubarlas en SFM y recolectar las proteínas secretadas. Se debe tener cuidado de no reventar las células, liberando proteínas intracelulares. [1] Además, el tiempo y las condiciones de incubación deben optimizarse para que el estrés metabólico que puede inducirse por la falta de nutrientes en SFM no afecte el análisis secretómico. [10]
Algunas proteínas se secretan en baja abundancia y luego se diluyen aún más en el medio de cultivo celular o en el fluido corporal, lo que dificulta su detección y análisis. Se pueden utilizar métodos de concentración como la precipitación con TCA [10] , así como métodos de alta sensibilidad como los microarreglos de anticuerpos que pueden detectar incluso moléculas individuales de una proteína. [11]
Muchos estudios secretómicos se llevan a cabo in vitro con métodos de cultivo celular, pero no está claro si las mismas proteínas se secretan in vivo . Cada vez más estudios, especialmente los que se centran en el secretoma del cáncer, utilizan métodos in vivo para confirmar la relevancia de los resultados obtenidos in vitro . Por ejemplo, se pueden recolectar fluidos biológicos proximales adyacentes a un tumor para realizar un análisis secretómico. [1]
Muchas proteínas secretadas tienen una secuencia de péptidos N-terminal que indica a la proteína traducida que se desplace hacia el retículo endoplasmático , donde se produce el procesamiento que finalmente conducirá a la secreción. La presencia de estos péptidos señal se puede utilizar para predecir el secretoma de una célula. [1] Algunas proteínas secretoras no tienen secuencias de péptidos señal clásicas. Estas se denominan "proteínas secretoras sin líder" (LSP).
Los métodos de predicción de todo el genoma presentan diversos problemas. Existe una alta probabilidad de falsos positivos y falsos negativos. Además, la expresión génica está muy influenciada por las condiciones ambientales, lo que significa que es poco probable que un secretoma predicho a partir del genoma o de una biblioteca de ADNc coincida completamente con el secretoma verdadero. [9] Los métodos proteómicos son necesarios para validar cualquier proteína secretada predicha.
Existen varias bases de datos o bases de conocimiento de secretomas de todo el genoma basadas tanto en la curación como en la predicción computacional. Estas bases de datos incluyen la base de datos de secretomas fúngicos (FSD), la base de conocimiento de secretomas fúngicos (FunSecKB), [12] y la base de datos de secretomas de bacterias del ácido láctico. [13] La base de datos de ubicación subcelular de proteínas humanas y animales (MetaSecKB) y la base de datos de proteomas subcelulares protistas (ProtSecKB) también se han publicado recientemente. Aunque existen algunas imprecisiones en la predicción computacional, estas bases de datos proporcionan recursos útiles para caracterizar aún más las ubicaciones subcelulares de las proteínas.
El análisis por espectrometría de masas es parte integral de la secretómica. El suero o el sobrenadante que contiene proteínas secretadas se digiere con una proteasa y las proteínas se separan mediante electroforesis en gel 2D o métodos cromatográficos . Luego, cada proteína individual se analiza mediante espectrometría de masas y la huella de masas de péptidos generada se puede ejecutar en una base de datos para identificar la proteína. [1]
El marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivos celulares (SILAC) ha surgido como un método importante en secretómica: ayuda a distinguir entre proteínas secretadas y contaminantes del suero bovino en cultivos celulares. El sobrenadante de células cultivadas en un medio normal y células cultivadas en un medio con aminoácidos marcados con isótopos estables se mezcla en una proporción de 1:1 y se analiza mediante espectrometría de masas. Los contaminantes proteicos en el suero solo mostrarán un pico porque no tienen un equivalente marcado. [1] Como ejemplo, el método SILAC se ha utilizado con éxito para distinguir entre proteínas secretadas por condrocitos humanos en cultivo y contaminantes del suero. [14]
Un microarray de anticuerpos es un método de alta sensibilidad y alto rendimiento para la detección de proteínas que recientemente se ha convertido en parte del análisis secretómico. Los anticuerpos , u otro tipo de molécula aglutinante, se fijan sobre un soporte sólido y se añade una mezcla de proteínas marcada con fluorescencia. Las intensidades de la señal se utilizan para identificar proteínas. Los microarrays de anticuerpos son extremadamente versátiles: se pueden utilizar para analizar la cantidad de proteína en una mezcla, diferentes isoformas de proteínas , modificaciones postraduccionales y la actividad bioquímica de las proteínas. Además, estos microarrays son altamente sensibles: pueden detectar moléculas individuales de proteína. Los microarrays de anticuerpos se utilizan actualmente principalmente para analizar muestras de plasma humano , pero también se pueden utilizar para células cultivadas y secretómica de fluidos corporales, presentando una forma sencilla de buscar la presencia de muchas proteínas a la vez. [11]
Además de ser importantes en los procesos fisiológicos normales, las proteínas secretadas también tienen un papel integral en la tumorigénesis a través del crecimiento celular, la migración, la invasión y la angiogénesis , lo que hace que la secretómica sea un método excelente para el descubrimiento de biomarcadores del cáncer. [15] El uso de un método proteómico de fluidos corporales o suero completo para identificar biomarcadores puede ser extremadamente difícil: los fluidos corporales son complejos y altamente variables. El análisis secretómico de líneas celulares cancerosas o tejido enfermo presenta una alternativa más simple y específica para el descubrimiento de biomarcadores. [10]
Las dos principales fuentes biológicas para la secretómica del cáncer son los sobrenadantes de las líneas celulares cancerosas y los fluidos biológicos proximales, los fluidos en contacto con un tumor . El sobrenadante de la línea celular cancerosa es una fuente atractiva de proteínas secretadas. Hay muchas líneas celulares estandarizadas disponibles y el sobrenadante es mucho más simple de analizar que el fluido corporal proximal. Pero no está claro si un secretoma de una línea celular es una buena representación de un tumor real en su microambiente específico y una línea celular estandarizada no es ilustrativa de la heterogeneidad de un tumor real. [15] El análisis de fluidos proximales puede dar una mejor idea de un secretoma tumoral humano, pero este método también tiene sus desventajas. Los procedimientos para recolectar fluidos proximales aún necesitan ser estandarizados y se necesitan controles no malignos. Además, las diferencias ambientales y genéticas entre pacientes pueden complicar el análisis. [15]
El análisis secretomático ha descubierto nuevos biomarcadores potenciales en muchos tipos de cáncer, incluidos el cáncer de pulmón , el cáncer de hígado , el cáncer de páncreas , el cáncer colorrectal , el cáncer de próstata y el cáncer de mama . El antígeno prostático específico (PSA), el biomarcador estándar actual para el cáncer de próstata, tiene una baja especificidad diagnóstica (los niveles de PSA no siempre pueden discriminar entre cáncer agresivo y no agresivo), por lo que se necesita urgentemente un mejor biomarcador. Mediante el análisis secretomático de líneas celulares de próstata, un estudio pudo descubrir múltiples proteínas encontradas en niveles más altos en el suero de pacientes con cáncer que en controles sanos. [10]
También existe una gran necesidad de biomarcadores para la detección del cáncer de mama; actualmente, los biomarcadores solo existen para monitorear etapas más avanzadas del cáncer. [2] El análisis secretómico de líneas celulares de cáncer de mama condujo al descubrimiento de la proteína ALCAM como un nuevo biomarcador con un potencial diagnóstico prometedor. [10]
El análisis del secretoma embrionario humano podría ser útil para encontrar un método no invasivo para determinar la viabilidad de los embriones . En la FIV , los embriones se evalúan según criterios morfológicos en un intento de encontrar aquellos con alto potencial de implantación . Encontrar un método de evaluación más cuantitativo podría ayudar a reducir el número de embriones utilizados en la FIV, reduciendo así los embarazos de orden superior . Por ejemplo, un estudio pudo desarrollar huellas dactilares del secretoma para muchos blastocistos y encontró 9 proteínas que podían distinguir entre blastocistos con números normales y anormales de cromosomas . Este tipo de análisis podría ayudar a reemplazar el cribado genético preimplantacional (PGS), que implica una biopsia de células embrionarias y puede ser perjudicial para el desarrollo. [16]