stringtranslate.com

Marcaje de isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares

Principio de SILAC . Las células se etiquetan de forma diferencial cultivándolas en un medio ligero con arginina normal (Arg-0, color azul) o en un medio con arginina pesada (Arg-6, color rojo). La incorporación metabólica de los aminoácidos a las proteínas produce un cambio de masa de los péptidos correspondientes. Este cambio de masa se puede detectar mediante un espectrómetro de masas , como lo indican los espectros de masas representados. Cuando se combinan ambas muestras, la relación de las intensidades de los picos en el espectro de masas refleja la abundancia relativa de proteínas. En este ejemplo, la proteína etiquetada tiene la misma abundancia en ambas muestras (relación 1).

El marcaje de isótopos estables por/con aminoácidos en cultivo celular ( SILAC ) es una técnica basada en espectrometría de masas que detecta diferencias en la abundancia de proteínas entre muestras utilizando marcaje isotópico no radiactivo . [1] [2] [3] [4] Es un método popular para la proteómica cuantitativa .

Procedimiento

Se cultivan dos poblaciones de células en un cultivo celular . Una de las poblaciones celulares se alimenta con un medio de crecimiento que contiene aminoácidos normales . Por el contrario, la segunda población se alimenta con un medio de crecimiento que contiene aminoácidos marcados con isótopos pesados ​​estables (no radiactivos) . Por ejemplo, el medio puede contener arginina marcada con seis átomos de carbono-13 ( 13 C) en lugar del carbono-12 normal ( 12 C). Cuando las células crecen en este medio, incorporan la arginina pesada a todas sus proteínas. A partir de entonces, todos los péptidos que contienen una sola arginina son 6 Da más pesados ​​que sus homólogos normales. Alternativamente, se puede utilizar un marcado uniforme con 13 C o 15 N. Las proteínas de ambas poblaciones celulares se combinan y se analizan juntas mediante espectrometría de masas , ya que los pares de péptidos químicamente idénticos de diferente composición de isótopos estables se pueden diferenciar en un espectrómetro de masas debido a su diferencia de masa. La relación de las intensidades máximas en el espectro de masas para dichos pares de péptidos refleja la relación de abundancia de las dos proteínas. [5] [3]

Aplicaciones

Se ha utilizado un enfoque SILAC que implica la incorporación de tirosina marcada con nueve átomos de carbono-13 ( 13 C) en lugar del carbono-12 normal ( 12 C) para estudiar los sustratos de la tirosina quinasa en las vías de señalización. [6] SILAC ha surgido como un método muy poderoso para estudiar la señalización celular , las modificaciones posteriores a la traducción como la fosforilación , [6] [7] la interacción proteína-proteína y la regulación de la expresión génica . Además, SILAC se ha convertido en un método importante en secretómica , el estudio global de las proteínas secretadas y las vías secretoras. [8] Se puede utilizar para distinguir entre las proteínas secretadas por las células en cultivo y los contaminantes del suero. [9] También se ha adaptado como un método SILAC "hacia adelante + hacia atrás" para el etiquetado simultáneo del huésped y el microbio, lo que permite el estudio de las interacciones huésped-microbio. [10] También se han publicado protocolos estandarizados de SILAC para varias aplicaciones. [11] [12]

SILAC pulsado

La SILAC pulsada (pSILAC) es una variante del método SILAC en la que los aminoácidos marcados se añaden al medio de crecimiento durante un breve período de tiempo. Esto permite controlar las diferencias en la producción de proteínas de novo en lugar de la concentración bruta. [13] [14]

Código Neutra SILAC

Tradicionalmente, el nivel de multiplexación en SILAC estaba limitado debido a la cantidad de isótopos SILAC disponibles. Recientemente, una nueva técnica llamada NeuCode (codificación de neutrones) SILAC ha aumentado el nivel de multiplexación alcanzable con el etiquetado metabólico (hasta 4). [15] El método de aminoácidos NeuCode es similar a SILAC, pero se diferencia en que el etiquetado solo utiliza aminoácidos pesados. El uso de solo aminoácidos pesados ​​elimina la necesidad de la incorporación del 100% de los aminoácidos necesarios para SILAC. La mayor capacidad de multiplexación de los aminoácidos NeuCode se debe al uso de defectos de masa de neutrones adicionales en los isótopos estables. Sin embargo, estas pequeñas diferencias de masa deben resolverse en espectrómetros de masas de alta resolución.

Referencias

  1. ^ Oda Y, Huang K, Cross FR, Cowburn D, Chait BT (junio de 1999). "Cuantificación precisa de la expresión de proteínas y la fosforilación específica del sitio". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 96 (12): 6591–6596. Bibcode :1999PNAS...96.6591O. doi : 10.1073/pnas.96.12.6591 . PMC  21959 . PMID  10359756.
  2. ^ Jiang H, English AM (2002). "Análisis cuantitativo del proteoma de la levadura mediante la incorporación de leucina marcada isotópicamente". Journal of Proteome Research . 1 (4): 345–350. doi :10.1021/pr025523f. PMID  12645890.
  3. ^ ab Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M (mayo de 2002). "Etiquetado de isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares, SILAC, como un enfoque simple y preciso para la proteómica de expresión". Proteómica molecular y celular . 1 (5): 376–386. doi : 10.1074/mcp.M200025-MCP200 . PMID  12118079.
  4. ^ Zhu H, Pan S, Gu S, Bradbury EM, Chen X (2002). "Etiquetado de isótopos estables específicos de residuos de aminoácidos para proteómica cuantitativa". Rapid Communications in Mass Spectrometry . 16 (22): 2115–2123. Bibcode :2002RCMS...16.2115Z. doi :10.1002/rcm.831. PMID  12415544.
  5. ^ Schoeters F, Van Dijck P (2019). "Interacciones proteína-proteína en Candida albicans". Fronteras en Microbiología . 10 : 1792. doi : 10.3389/fmicb.2019.01792 . PMC 6693483 . PMID  31440220. 
  6. ^ ab Ibarrola N, Molina H, Iwahori A, Pandey A (abril de 2004). "Un nuevo enfoque proteómico para la identificación específica de sustratos de tirosina quinasa utilizando [13C]tirosina". The Journal of Biological Chemistry . 279 (16): 15805–15813. doi : 10.1074/jbc.M311714200 . PMID  14739304.
  7. ^ Ibarrola N, Kalume DE, Gronborg M, Iwahori A, Pandey A (noviembre de 2003). "Un enfoque proteómico para la cuantificación de la fosforilación utilizando el marcaje de isótopos estables en cultivos celulares". Química analítica . 75 (22): 6043–6049. doi :10.1021/ac034931f. PMID  14615979.
  8. ^ Hathout Y (abril de 2007). "Enfoques para el estudio del secretoma celular". Expert Review of Proteomics . 4 (2): 239–248. doi :10.1586/14789450.4.2.239. PMID  17425459. S2CID  26169223.
  9. ^ Polacek M, Bruun JA, Johansen O, Martinez I (agosto de 2010). "Diferencias en el secretoma de explantos de cartílago y condrocitos cultivados reveladas por la tecnología SILAC". Journal of Orthopaedic Research . 28 (8): 1040–1049. doi : 10.1002/jor.21067 . PMID  20108312. S2CID  41057768.
  10. ^ Liu, Yang Sylvia; Zhang, Chengqian; Khoo, Bee Luan; Hao, Piliang; Chua, Song Lin (2024-09-02). "Proteómica de especies duales e intervención dirigida de interacciones animal-patógeno". Revista de investigación avanzada . doi : 10.1016/j.jare.2024.08.038 . ISSN  2090-1232.
  11. ^ Amanchy R, Kalume DE, Pandey A (enero de 2005). "Etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivos celulares (SILAC) para estudiar la dinámica de la abundancia de proteínas y las modificaciones postraduccionales". Science's STKE . 2005 (267): pl2. doi :10.1126/stke.2672005pl2. PMID  15657263. S2CID  12089034.
  12. ^ Harsha HC, Molina H, Pandey A (2008). "Proteómica cuantitativa utilizando el marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivos celulares". Nature Protocols . 3 (3): 505–516. doi :10.1038/nprot.2008.2. PMID  18323819. S2CID  24190501.
  13. ^ Schwanhäusser B, Gossen M, Dittmar G, Selbach M (enero de 2009). "Análisis global de la traducción de proteínas celulares mediante SILAC pulsado". Proteómica . 9 (1): 205–209. doi :10.1002/pmic.200800275. PMID  19053139. S2CID  23130202.
  14. ^ Chua, canción Lin; Ñame, Joey Kuok Hoong; Hao, Piliang; Adav, Sunil S.; Salido, May Margarette; Liu, Yang; Givskov, Michael; Sze, Siu Kwan; Tolker-Nielsen, Tim; Yang, Liang (19 de febrero de 2016). "Etiquetado selectivo y erradicación de poblaciones bacterianas tolerantes a antibióticos en biopelículas de Pseudomonas aeruginosa". Comunicaciones de la naturaleza . 7 (1): 10750. doi : 10.1038/ncomms10750. ISSN  2041-1723. PMC 4762895 . 
  15. ^ Merrill AE, Hebert AS, MacGilvray ME, Rose CM, Bailey DJ, Bradley JC, et al. (septiembre de 2014). "Etiquetas NeuCode para cuantificación relativa de proteínas". Molecular & Cellular Proteomics . 13 (9): 2503–2512. doi : 10.1074/mcp.M114.040287 . PMC 4159665 . PMID  24938287. 

Lectura adicional

Enlaces externos