En bioinformática , una huella de masa de péptidos o mapa de masa de péptidos es un espectro de masas de una mezcla de péptidos que proviene de una proteína digerida que se está analizando. El espectro de masas funciona como una huella digital en el sentido de que es un patrón que puede servir para identificar la proteína. [1] El método para formar una huella de masa de péptidos, desarrollado en 1993, consiste en aislar una proteína, descomponerla en péptidos individuales y determinar las masas de los péptidos mediante alguna forma de espectrometría de masas. [2] Una vez formada, una huella de masa de péptidos se puede utilizar para buscar en bases de datos proteínas relacionadas o incluso secuencias genómicas, lo que la convierte en una poderosa herramienta para la anotación de genes codificadores de proteínas. [3]
Una de las principales ventajas de la identificación masiva es que es mucho más rápida de realizar que la secuenciación de péptidos , pero los resultados son igualmente útiles. [4] Las desventajas incluyen la necesidad de una sola proteína para el análisis y el requisito de que la secuencia de la proteína esté ubicada, al menos con una homología significativa, en una base de datos. Debido a que la masa de los péptidos individuales se mide al formar una huella digital, las mezclas de diferentes proteínas pueden producir resultados poco confiables. Por lo tanto, la preparación de la muestra es un paso importante en el proceso. Incluso entonces, si se obtienen resultados confiables, debe haber una secuencia de péptidos coincidente en la base de datos que está buscando para que los resultados sean útiles. [5]
Antes de analizar una proteína con espectrometría de masas, es necesario aislarla y digerirla con precisión. Si no se aísla, los resultados representarán una mezcla de dos o más proteínas y, por lo tanto, no serán confiables para su identificación. Debido a esta sensibilidad, la preparación de la muestra es probablemente el paso más importante para formar una huella de masa peptídica.
El aislamiento de una proteína específica se realiza con mayor frecuencia mediante una forma de electroforesis en gel , en la que las proteínas se separan por tamaño y pueden extraerse posteriormente para una preparación adicional. Sin embargo, también se pueden aislar mediante cromatografía líquida . Este método también separa las proteínas por tamaño. [6]
Una vez aislada una proteína individual, es necesario digerirla y fraccionarla para su posterior análisis mediante un espectrómetro. Esto se hace mediante la adición de enzimas proteolíticas como la tripsina y la quimotripsina . [7]
Otro método comúnmente utilizado que combina los pasos de aislamiento y digestión es SDS-PAGE , una forma de electroforesis que separa y fracciona las proteínas simultáneamente.
La proteína digerida se puede analizar con diferentes tipos de espectrómetros de masas como ESI-TOF o MALDI-TOF . MALDI-TOF es a menudo el instrumento preferido porque permite un alto rendimiento de muestra y se pueden analizar varias proteínas en un solo experimento, si se complementa con análisis MS/MS . [8]
En la desorción por ionización láser asistida por matriz (MALDI), se carga una muestra de péptido fragmentado en una matriz y se ioniza mediante el uso de un láser de alta energía. Luego, los iones fragmentados se separan por la relación masa-carga en función del tiempo de vuelo (TOF) a través del espectrómetro. Luego, se pueden fragmentar aún más y volver a analizar en espectrometría de masas en tándem, a menudo con una trampa de iones cuadrupolo [9] , pero también es posible con tiempo de vuelo en tándem [10] .
La salida que se recibe de un espectrómetro de masas se presenta en forma de una lista de picos. Este espectro muestra las masas y abundancias relativas de los fragmentos de péptidos presentes en la muestra. Al leer un espectro como el que se muestra, se deben considerar todas las posibles fragmentaciones principales de una proteína. Luego, las masas de esos fragmentos se correlacionarían con los números en los picos del espectro. Si bien se puede analizar hasta cierto punto por sí solo, al formar una huella de masa de péptido, la lista de picos se ejecuta a través de una búsqueda en una base de datos para encontrar secuencias de péptidos homólogos.
La lista de picos obtenida a través de medios espectrométricos se utiliza como consulta en una búsqueda de base de datos utilizando el software MASCOT . [11] El software MASCOT utiliza un algoritmo que busca homología de secuencia de péptidos significativa para presentar la proteína estadísticamente más probable en la muestra, según los resultados.
Al realizar la búsqueda, debe elegir una base de datos para consultar. Entre estas bases de datos se incluyen Swissprot, que se utiliza a menudo cuando se investigan organismos bien caracterizados, como seres humanos, ratones y levaduras, y NCBInr para búsquedas más generales y sólidas.
Puede encontrar un tutorial detallado sobre el uso del software MASCOT en el siguiente enlace.
El uso de una huella de masa peptídica está bastante extendido en la investigación proteómica. Algunos ejemplos específicos de cómo se ha utilizado en este campo son los siguientes:
Los autores de este estudio intentaron determinar qué levaduras eran metabólicamente activas a temperaturas más bajas y, por lo tanto, podían utilizarse para procesos industriales más fríos. Cultivaron varias levaduras en un medio a diferentes temperaturas y luego determinaron la actividad enzimática separando las proteínas en un gel y tomando las huellas digitales de las bandas individuales. A través de una búsqueda en bases de datos, encontraron la enzima de interés y descubrieron dos levaduras individuales que tenían una mayor actividad a temperaturas más bajas. [12]
Los autores de este estudio intentaron determinar el efecto del fármaco risperidona sobre el metabolismo en pacientes con esquizofrenia. Después de descubrir que la risperidona tenía efectos secundarios metabólicos negativos, analizaron las proteínas de membrana para el transporte de glucosa y lípidos en grupos de control y experimentales mediante MALDI-TOF y huellas dactilares. Los resultados mostraron huellas dactilares alteradas y, por lo tanto, niveles alterados de plegamiento en las proteínas. Por lo tanto, concluyeron que la risperidona afecta negativamente a las proteínas de transporte de glucosa y lípidos en las membranas celulares de los pacientes. [13]