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Proteómica de escopeta

La proteómica de escopeta se refiere al uso de técnicas de proteómica de abajo hacia arriba para identificar proteínas en mezclas complejas utilizando una combinación de cromatografía líquida de alto rendimiento combinada con espectrometría de masas . [1] [2] [3] [4] [5] [6] El nombre se deriva de la secuenciación de escopeta de ADN , que a su vez recibe su nombre del patrón de disparo cuasialeatorio de rápida expansión de una escopeta . El método más común de proteómica de escopeta comienza con las proteínas en la mezcla que se digieren y los péptidos resultantes se separan mediante cromatografía líquida. Luego se utiliza la espectrometría de masas en tándem para identificar los péptidos.

La proteómica dirigida que utiliza SRM y métodos de adquisición independientes de los datos se consideran a menudo alternativas a la proteómica shotgun en el campo de la proteómica ascendente . Mientras que la proteómica shotgun utiliza la selección dependiente de los datos de iones precursores para generar escaneos de iones de fragmentos, los métodos antes mencionados utilizan un método determinista para la adquisición de escaneos de iones de fragmentos.

Historia

La proteómica de escopeta surgió de las dificultades de usar tecnologías anteriores para separar mezclas complejas. En 1975, O'Farrell y Klose describieron la electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional ( 2D-PAGE ) con la capacidad de resolver mezclas complejas de proteínas. [7] [8] El desarrollo de la ionización por desorción láser asistida por matriz ( MALDI ), la ionización por electrospray ( ESI ) y la búsqueda en bases de datos continuaron haciendo crecer el campo de la proteómica. Sin embargo, estos métodos aún tenían dificultades para identificar y separar proteínas de baja abundancia, proteínas aberrantes y proteínas de membrana. La proteómica de escopeta surgió como un método que podría resolver incluso estas proteínas. [5]

Ventajas

La proteómica de escopeta permite la identificación global de proteínas, así como la capacidad de perfilar sistemáticamente proteomas dinámicos. [9] También evita la modesta eficiencia de separación y la baja sensibilidad espectral de masas asociadas con el análisis de proteínas intactas. [1]

Desventajas

El filtrado de exclusión dinámica que se utiliza a menudo en la proteómica shotgun maximiza el número de proteínas identificadas a expensas del muestreo aleatorio. [10] Este problema puede verse exacerbado por el submuestreo inherente a la proteómica shotgun. [11]

CLAR Agilent 1200
Espectrómetro de masas en tándem de tiempo de vuelo cuadrupolo (Q-TOF)

Flujo de trabajo

Se cultivan células que contienen el complemento proteico deseado. A continuación, se extraen las proteínas de la mezcla y se digieren con una proteasa para producir una mezcla de péptidos. [9] A continuación, la mezcla de péptidos se carga directamente en una columna microcapilar y los péptidos se separan por hidrofobicidad y carga. A medida que los péptidos se eluyen de la columna, se ionizan y se separan por m/z en la primera etapa de la espectrometría de masas en tándem . Los iones seleccionados experimentan una disociación inducida por colisión u otro proceso para inducir la fragmentación. Los fragmentos cargados se separan en la segunda etapa de la espectrometría de masas en tándem.

La "huella digital" del espectro de masas de fragmentación de cada péptido se utiliza para identificar la proteína de la que derivan mediante una búsqueda en una base de datos de secuencias con un software disponible comercialmente (por ejemplo, Sequest o Mascot ). [9] Algunos ejemplos de bases de datos de secuencias son la base de datos Genpept o la base de datos PIR. [12] Después de la búsqueda en la base de datos, cada coincidencia de espectro de péptidos (PSM) debe evaluarse para determinar su validez. [13] Este análisis permite a los investigadores perfilar varios sistemas biológicos. [9]

Desafíos en la identificación de péptidos

Los péptidos degenerados (compartidos por dos o más proteínas en la base de datos) dificultan la identificación inequívoca de la proteína a la que pertenecen. Además, algunas muestras de proteoma de vertebrados tienen una gran cantidad de parálogos , y el empalme alternativo en eucariotas superiores puede dar como resultado muchas subsecuencias de proteínas idénticas. [1] Además, muchas proteínas se modifican de forma natural (co- o postraduccional) o artificial (artefactos de preparación de muestras). Esto desafía aún más la identificación de la secuencia de péptidos mediante enfoques de coincidencia de bases de datos convencionales. Junto con los espectros de fragmentación de péptidos de mala calidad o alta complejidad (debido al coaislamiento o limitaciones de sensibilidad), esto deja en un experimento de proteómica shotgun convencional muchos espectros de secuenciación sin identificar. [14] [15] [16] [17]

Aplicaciones prácticas

Una vez secuenciado el genoma humano, el siguiente paso es la verificación y anotación funcional de todos los genes previstos y sus productos proteicos. [4] La proteómica shotgun se puede utilizar para la clasificación funcional o el análisis comparativo de estos productos proteicos. Se puede utilizar en proyectos que van desde el proteoma completo a gran escala hasta proyectos centrados en una sola familia de proteínas. Se puede realizar en laboratorios de investigación o de forma comercial.

Análisis a gran escala

Un ejemplo de esto es un estudio de Washburn, Wolters y Yates en el que utilizaron la proteómica shotgun en el proteoma de una cepa de Saccharomyces cerevisiae cultivada hasta la fase logarítmica media. Pudieron detectar e identificar 1.484 proteínas, así como identificar proteínas que rara vez se ven en el análisis del proteoma, incluidas proteínas de baja abundancia como factores de transcripción y proteínas quinasas . También pudieron identificar 131 proteínas con tres o más dominios transmembrana previstos . [2]

Familia de proteínas

Vaisar et al. utilizan la proteómica shotgun para implicar la inhibición de la proteasa y la activación del complemento en las propiedades antiinflamatorias de la lipoproteína de alta densidad . [18] En un estudio de Lee et al., se observó un mayor nivel de expresión de hnRNP A2/B1 y Hsp90 en las células de hepatoma humano HepG2 que en las células de tipo salvaje. Esto condujo a una búsqueda de roles funcionales informados mediados en conjunto por estas dos chaperonas celulares multifuncionales. [19]

Véase también

Referencias

  1. ^ abc Alves P, Arnold RJ, Novotny MV, Radivojac P, Reilly JP, Tang H (2007). "Avances en la inferencia de proteínas a partir de la proteómica de escopeta utilizando detectabilidad de péptidos". Simposio del Pacífico sobre Bioinformática. Simposio del Pacífico sobre Bioinformática : 409–20. PMID  17990506.
  2. ^ ab Washburn MP, Wolters D, Yates JR (marzo de 2001). "Análisis a gran escala del proteoma de la levadura mediante tecnología de identificación de proteínas multidimensional". Nature Biotechnology . 19 (3): 242–7. doi :10.1038/85686. PMID  11231557. S2CID  16796135.
  3. ^ Wolters DA, Washburn MP, Yates JR (diciembre de 2001). "Una tecnología de identificación de proteínas multidimensional automatizada para la proteómica de escopeta". Química analítica . 73 (23): 5683–90. doi :10.1021/ac010617e. PMID  11774908.
  4. ^ ab Hu L, Ye M, Jiang X, Feng S, Zou H (agosto de 2007). "Avances en técnicas analíticas con guiones para el análisis de proteomas y peptidomas shotgun: una revisión". Analytica Chimica Acta . 598 (2): 193–204. doi :10.1016/j.aca.2007.07.046. PMID  17719892.
  5. ^ ab Fournier ML, Gilmore JM, Martin-Brown SA, Washburn MP (agosto de 2007). "Proteómica shotgun basada en separaciones multidimensionales". Chemical Reviews . 107 (8): 3654–86. doi :10.1021/cr068279a. PMID  17649983.
  6. ^ Nesvizhskii AI (2007). "Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas en tándem y búsqueda en bases de datos de secuencias". Análisis de datos de espectrometría de masas en proteómica . Métodos Mol. Biol. Vol. 367. págs. 87–119. doi :10.1385/1-59745-275-0:87. ISBN 978-1-59745-275-5. Número de identificación personal  17185772.
  7. ^ O'Farrell PH (mayo de 1975). "Electroforesis bidimensional de proteínas de alta resolución". The Journal of Biological Chemistry . 250 (10): 4007–21. doi : 10.1016/S0021-9258(19)41496-8 . PMC 2874754 . PMID  236308. 
  8. ^ Klose J (1975). "Mapeo de proteínas mediante la combinación de isoelectroenfoque y electroforesis de tejidos de ratón. Un nuevo enfoque para la prueba de mutaciones puntuales inducidas en mamíferos". Humangenetik . 26 (3): 231–43. doi :10.1007/bf00281458. PMID  1093965. S2CID  30981877.
  9. ^ abcd Wu CC, MacCoss MJ (junio de 2002). "Proteómica de escopeta: herramientas para el análisis de sistemas biológicos complejos". Current Opinion in Molecular Therapeutics . 4 (3): 242–50. PMID  12139310.
  10. ^ Zhang B, VerBerkmoes NC, Langston MA, Uberbacher E, Hettich RL, Samatova NF (noviembre de 2006). "Detección de la expresión proteica diferencial y correlacionada en la proteómica shotgun sin etiqueta". Journal of Proteome Research . 5 (11): 2909–18. doi :10.1021/pr0600273. PMID  17081042. S2CID  22254554.
  11. ^ Tolmachev AV, Monroe ME, Purvine SO, Moore RJ, Jaitly N, Adkins JN, et al. (noviembre de 2008). "Caracterización de estrategias para obtener identificaciones confiables en mediciones de proteómica de abajo hacia arriba utilizando instrumentos FTMS híbridos". Química analítica . 80 (22): 8514–25. doi :10.1021/ac801376g. PMC 2692492 . PMID  18855412. 
  12. ^ Eng JK, McCormack AL, Yates JR (noviembre de 1994). "Un enfoque para correlacionar datos espectrales de masas en tándem de péptidos con secuencias de aminoácidos en una base de datos de proteínas". Journal of the American Society for Mass Spectrometry . 5 (11): 976–89. CiteSeerX 10.1.1.377.3188 . doi : 10.1016/1044-0305(94)80016-2 . PMID  24226387. S2CID  18413192. 
  13. ^ Cerqueira FR, Ferreira RS, Oliveira AP, Gomes AP, Ramos HJ, Graber A, Baumgartner C (1 de enero de 2012). "MUMAL: análisis multivariado en proteómica shotgun utilizando técnicas de aprendizaje automático". BMC Genomics . 13 (Supl 5): S4. doi : 10.1186/1471-2164-13-S5-S4 . PMC 3477001 . PMID  23095859. 
  14. ^ Griss J, Perez-Riverol Y, Lewis S, Tabb DL, Dianes JA, Del-Toro N, et al. (agosto de 2016). "Reconocimiento de millones de espectros no identificados de manera consistente en cientos de conjuntos de datos de proteómica de escopeta". Nature Methods . 13 (8): 651–656. doi :10.1038/nmeth.3902. PMC 4968634 . PMID  27493588. 
  15. ^ den Ridder M, Daran-Lapujade P, Pabst M (febrero de 2020). "Proteómica de escopeta: por qué miles de señales no identificadas son importantes". FEMS Yeast Research . 20 (1). doi : 10.1093/femsyr/foz088 . PMID  31860055.
  16. ^ Michalski A, Cox J, Mann M (abril de 2011). "Más de 100.000 especies de péptidos detectables se eluyen en ejecuciones proteómicas de una sola escopeta, pero la mayoría es inaccesible a la LC-MS/MS dependiente de los datos". Journal of Proteome Research . 10 (4): 1785–93. doi :10.1021/pr101060v. PMID  21309581.
  17. ^ Devabhaktuni A, Lin S, Zhang L, Swaminathan K, Gonzalez CG, Olsson N, et al. (abril de 2019). "TagGraph revela vastos paisajes de modificación de proteínas a partir de grandes conjuntos de datos de espectrometría de masas en tándem". Nature Biotechnology . 37 (4): 469–479. doi :10.1038/s41587-019-0067-5. PMC 6447449 . PMID  30936560. 
  18. ^ Vaisar T, Pennathur S, Green PS, Gharib SA, Hoofnagle AN, Cheung MC, et al. (marzo de 2007). "La proteómica de escopeta implica la inhibición de la proteasa y la activación del complemento en las propiedades antiinflamatorias de HDL". The Journal of Clinical Investigation . 117 (3): 746–56. doi :10.1172/JCI26206. PMC 1804352 . PMID  17332893. 
  19. ^ Lee CL, Hsiao HH, Lin CW, Wu SP, Huang SY, Wu CY, et al. (diciembre de 2003). "Enfoque proteómico estratégico de escopeta para la construcción eficiente de un mapa de expresión de familias de proteínas específicas en líneas celulares de hepatoma". Proteómica . 3 (12): 2472–86. doi : 10.1002/pmic.200300586 . PMID  14673797. S2CID  24518852.

Lectura adicional

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