La poli(amidoamina) , o PAMAM , es una clase de dendrímero que está formada por subunidades ramificadas repetidamente con funcionalidad amida y amina . Los dendrímeros PAMAM, a veces denominados por el nombre comercial Starburst, han sido ampliamente estudiados desde su síntesis en 1985, [1] y representan la familia de dendrímeros mejor caracterizada, así como los primeros en comercializarse. [2] Al igual que otros dendrímeros, los PAMAM tienen una forma general similar a una esfera y se caracterizan por una arquitectura molecular interna que consiste en una ramificación similar a un árbol, y cada "capa" externa, o generación, contiene exponencialmente más puntos de ramificación. Esta arquitectura ramificada distingue a los PAMAM y otros dendrímeros de los polímeros tradicionales , ya que permite una baja polidispersidad y un alto nivel de control estructural durante la síntesis, y da lugar a una gran cantidad de sitios de superficie en relación con el volumen molecular total. Además, los dendrímeros PAMAM exhiben una mayor biocompatibilidad que otras familias de dendrímeros, quizás debido a la combinación de aminas superficiales y enlaces amida interiores; estos motivos de enlace recuerdan mucho a la química biológica innata y dotan a los dendrímeros PAMAM de propiedades similares a las de las proteínas globulares . [2] La relativa facilidad/bajo costo de síntesis de los dendrímeros PAMAM (especialmente en relación con moléculas biológicas de tamaño similar como proteínas y anticuerpos), junto con su biocompatibilidad, control estructural y funcionalizabilidad, han hecho que los PAMAM sean candidatos viables para su aplicación en el desarrollo de fármacos, la bioquímica y la nanotecnología . [2] [3] [4]
La síntesis divergente se refiere al "crecimiento" secuencial de un dendrímero capa por capa, comenzando con una molécula "iniciadora" central que contiene grupos funcionales capaces de actuar como sitios activos en la reacción inicial. Cada reacción subsiguiente en la serie aumenta exponencialmente el número de grupos superficiales disponibles. Las moléculas centrales que dan lugar a los dendrímeros PAMAM pueden variar, pero los iniciadores más básicos son el amoníaco y la etilendiamina. [6] El crecimiento externo de los dendrímeros PAMAM se logra alternando entre dos reacciones:
Cada ronda de reacciones forma una nueva "generación", y los dendrímeros PAMAM suelen clasificarse por número de generación; la abreviatura común para esta clasificación es "GX" o "GX PAMAM", donde X es un número que hace referencia al número de generación. El primer ciclo completo de adición de Michael seguido del acoplamiento con etilendiamina forma la Generación 0 de PAMAM, con adiciones de Michael posteriores que dan lugar a generaciones "medias" y el posterior acoplamiento de amida que da lugar a generaciones "completas" (enteras).
En la síntesis divergente de dendrímeros, es sumamente importante permitir que cada reacción se complete; cualquier defecto causado por una reacción incompleta o por el acoplamiento intramolecular de nuevas aminas superficiales con grupos superficiales de ésteres metílicos que no reaccionaron podría causar generaciones "rezagadas", lo que impediría el crecimiento posterior de ciertas ramas. Estas impurezas son difíciles de eliminar cuando se utiliza el enfoque sintético divergente porque el peso molecular, el tamaño físico y las propiedades químicas de los dendrímeros defectuosos son muy similares en naturaleza al producto deseado. A medida que aumenta el número de generaciones, se vuelve más difícil producir productos puros de manera oportuna debido a las restricciones estéricas. Como resultado, la síntesis de dendrímeros PAMAM de generaciones superiores puede llevar meses.
La síntesis convergente de un dendrímero comienza con lo que eventualmente se convertirá en la superficie del dendrímero y continúa hacia adentro. El enfoque sintético convergente hace uso de grupos protectores ortogonales (dos grupos protectores cuyas condiciones de desprotección no se eliminarán entre sí); esta es una consideración adicional que no está presente cuando se utiliza un enfoque divergente. La siguiente figura muestra un esquema general para un enfoque sintético convergente.
La síntesis convergente, como se muestra arriba, comienza con la subunidad dendrítica compuesta por el "grupo focal" reactivo A y el grupo ramificado B ( B puede tener múltiples ramificaciones en el escenario más generalizado, pero los PAMAM solo se dividen una vez en cada punto de ramificación). Primero, A se protege ortogonalmente y se reserva para reacciones posteriores. B también se protege ortogonalmente, dejando que la A desprotegida en esta molécula se acople con cada uno de los grupos B desprotegidos del compuesto inicial. Esto da como resultado una nueva especie de generación superior que está protegida tanto en A como en B. La desprotección selectiva de A produce una nueva molécula que se puede acoplar nuevamente al monómero original, formando así otra nueva generación. Luego, este proceso se puede repetir para formar más y más capas.
Se ha establecido que las macromoléculas catiónicas en general desestabilizan la membrana celular , lo que puede conducir a la lisis y muerte celular . [9] La conclusión común presente en el trabajo actual se hace eco de esta observación: aumentar el peso molecular y la carga superficial del dendrímero (ambos dependientes de la generación) aumenta su comportamiento citotóxico. [10] [11] [12] [13] [14] [15]
Los estudios iniciales sobre la toxicidad de PAMAM mostraron que PAMAM era menos tóxico (en algunos casos, mucho menos) que los dendrímeros relacionados, [16] exhibiendo una citotoxicidad mínima en múltiples pruebas de toxicidad, incluidas pruebas de actividad metabólica ( ensayo MTT ), descomposición celular (ensayo LDH) y morfología del núcleo ( tinción DAPI ). [10] Sin embargo, en otras líneas celulares , el ensayo MTT y varios otros ensayos revelaron cierta citotoxicidad. [12] [13] Estas observaciones dispares podrían deberse a diferencias en la sensibilidad de las diversas líneas celulares utilizadas en cada estudio a PAMAM; aunque la citotoxicidad para PAMAM varía entre líneas celulares, siguen siendo menos tóxicas que otras familias de dendrímeros en general.
Más recientemente, una serie de estudios de Mukherjee et al. [13] [14] [15] han arrojado algo de luz sobre el mecanismo de citotoxicidad de PAMAM, proporcionando evidencia de que los dendrímeros se liberan de su membrana encapsulante ( endosoma ) después de ser absorbidos por la célula, causando daño a las mitocondrias de la célula y eventualmente conduciendo a la muerte celular. Una mayor elucidación del mecanismo de citotoxicidad de PAMAM ayudaría a resolver la disputa sobre cuán tóxicos son exactamente los dendrímeros.
En relación con la toxicidad neuronal, se ha demostrado que el PAMAM de cuarta generación descompone los transitorios de calcio, alterando la dinámica de las vesículas de neurotransmisores y la transmisión sináptica. Todo lo anterior se puede prevenir reemplazando las aminas superficiales con folato o polietilenglicol. [17]
También se ha demostrado que los dendrímeros PAMAM causan la ruptura de los glóbulos rojos o hemólisis . [12] Por lo tanto, si se deben considerar los dendrímeros PAMAM en aplicaciones biológicas que involucran dendrímeros o complejos de dendrímeros que viajan a través del torrente sanguíneo, se debe tener en cuenta la concentración y el número de generación de PAMAM no modificado en el torrente sanguíneo.
Hasta la fecha, se han llevado a cabo pocos estudios en profundidad sobre el comportamiento in vivo de los dendrímeros PAMAM. Esto podría deberse en parte al comportamiento diverso de los PAMAM en función de la modificación de la superficie (ver más abajo), lo que hace que la caracterización de sus propiedades in vivo dependa en gran medida del caso. No obstante, el destino y el transporte de los dendrímeros PAMAM no modificados es un estudio de caso importante, ya que cualquier aplicación biológica podría implicar PAMAM no modificado como subproducto metabólico. En el único estudio sistemático importante del comportamiento in vivo de los PAMAM, las inyecciones de altos niveles de PAMAM desnudos durante períodos prolongados de tiempo en ratones no mostraron evidencia de toxicidad hasta el PAMAM G5, y para el PAMAM G3-G7, se observó una baja inmunogenicidad . [11] Estas observaciones a nivel sistémico parecen alinearse con la observación de que los dendrímeros PAMAM no son extremadamente citotóxicos en general; sin embargo, se requieren estudios más profundos de la farmacocinética y la biodistribución del PAMAM antes de poder avanzar hacia aplicaciones in vivo .
Una propiedad única de los dendrímeros como PAMAM es la alta densidad de grupos funcionales de superficie , que permiten realizar muchas alteraciones en la superficie de cada molécula de dendrímero. En los supuestos dendrímeros PAMAM, la superficie está plagada de aminas primarias, y las generaciones superiores expresan densidades exponencialmente mayores de grupos amino. Aunque el potencial para unir muchas cosas a cada dendrímero es una de sus mayores ventajas, la presencia de cargas positivas altamente localizadas puede ser tóxica para las células. La modificación de la superficie mediante la unión de grupos acetilo [18] y lauroilo [19] ayuda a enmascarar estas cargas positivas, atenuando la citotoxicidad y aumentando la permeabilidad a las células. Por lo tanto, este tipo de modificaciones son especialmente beneficiosas para aplicaciones biológicas. También se ha descubierto que los grupos superficiales de amino secundarios y terciarios son menos tóxicos que los grupos superficiales de amino primarios, [10] lo que sugiere que es el blindaje de carga lo que tiene una influencia importante en la citotoxicidad y no algún efecto secundario de un grupo funcional en particular. Además, otros estudios apuntan a un delicado equilibrio de carga que debe lograrse para obtener una citotoxicidad mínima. Las interacciones hidrofóbicas también pueden causar lisis celular, y los dendrímeros PAMAM cuyas superficies están saturadas con modificaciones no polares como lípidos o polietilenglicol (PEG) sufren una citotoxicidad mayor que sus análogos parcialmente sustituidos. [19] También se ha demostrado que los dendrímeros PAMAM con componentes internos no polares inducen hemólisis. [12]
Las aplicaciones que involucran dendrímeros en general aprovechan la posibilidad de introducir carga en el interior del dendrímero (a veces denominado "caja dendrítica") o de fijar la carga a la superficie del dendrímero. Las aplicaciones de los dendrímeros PAMAM generalmente se han centrado en la modificación de la superficie, aprovechando los métodos electrostáticos y covalentes para unir la carga. Actualmente, las principales áreas de estudio que utilizan dendrímeros PAMAM y sus derivados funcionalizados involucran la administración de fármacos y la administración de genes.
Dado que los dendrímeros PAMAM han demostrado capacidad de penetración en una amplia gama de líneas celulares, los complejos simples de PAMAM-fármaco afectarían a un amplio espectro de células tras su introducción en un sistema vivo. Por lo tanto, se requieren ligandos de orientación adicionales para la penetración selectiva de tipos de células. Por ejemplo, el PAMAM derivatizado con ácido fólico es absorbido preferentemente por células cancerosas , que se sabe que sobreexpresan el receptor de folato en sus superficies. La unión de métodos de tratamiento adicionales junto con el ácido fólico, como los isótopos de boro , [20] cisplatino [ 21] y metotrexato han demostrado ser bastante eficaces. [22] En el futuro, a medida que el control sintético sobre la química de la superficie del dendrímero se vuelva más sólido, el PAMAM y otras familias de dendrímeros pueden cobrar importancia junto con otros enfoques importantes para la terapia dirigida contra el cáncer.
En un estudio de PAMAM funcionalizado con ácido fólico, se combinó metotrexato como un complejo de inclusión dentro del dendrímero o como una unión superficial covalente. En el caso del complejo de inclusión, el fármaco se liberó del interior del dendrímero casi inmediatamente cuando se lo sometió a condiciones biológicas y actuó de manera similar al fármaco libre. El enfoque de unión superficial produjo complejos estables y solubles que pudieron dirigirse selectivamente a las células cancerosas y no liberaron prematuramente su carga. [22] La liberación del fármaco en el caso del complejo de inclusión podría explicarse por la protonación de las aminas superficiales e interiores en condiciones biológicas, lo que conduce a la desintegración de la conformación del dendrímero y la consiguiente liberación de la carga interna. Se observó un fenómeno similar con complejos de PAMAM y cisplatino. [23]
Los dendrímeros PAMAM también han demostrado propiedades farmacológicas intrínsecas. Un ejemplo bastante notable es la capacidad de los dendrímeros PAMAM para eliminar los agregados de proteínas priónicas , [24] los agregados proteínicos mortales responsables de la encefalopatía espongiforme bovina ("enfermedad de las vacas locas") y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos. La solubilización de los priones se atribuye a la naturaleza policatiónica y dendrímera de los PAMAM, siendo los dendrímeros de generación superior (>G3) los más eficientes; los PAMAM con terminación hidroxi, así como los polímeros lineales, mostraron poco o ningún efecto. Dado que no se conocen otros compuestos capaces de disolver los priones que ya se han agregado, los dendrímeros PAMAM han ofrecido un pequeño respiro en el estudio de estas enfermedades mortales y pueden ofrecer información adicional sobre el mecanismo de formación de priones.
El descubrimiento de que la mediación de la carga positiva en las superficies de los dendrímeros PAMAM disminuye su citotoxicidad tiene implicaciones interesantes para las aplicaciones de transfección de ADN . Debido a que la membrana celular tiene un exterior cargado negativamente, y la cadena principal de fosfato del ADN también está cargada negativamente, la transfección de ADN libre no es muy eficiente simplemente debido a la repulsión de carga. Sin embargo, sería razonable esperar interacciones cargadas entre la cadena principal de fosfato aniónico del ADN y los grupos de superficie con terminación amino de los dendrímeros PAMAM, que están ionizados positivamente en condiciones fisiológicas. Esto podría dar como resultado un complejo PAMAM-ADN, que haría que la transfección de ADN fuera más eficiente debido a la neutralización de las cargas en ambos elementos, mientras que la citotoxicidad del dendrímero PAMAM también se reduciría. De hecho, varios informes han confirmado que los dendrímeros PAMAM son agentes de transfección de ADN eficaces. [16] [26] [27] [28]
Cuando el balance de carga entre los fosfatos de ADN y las aminas superficiales de PAMAM es ligeramente positivo, se obtiene la máxima eficiencia de transfección; [23] este hallazgo apoya la idea de que el complejo se une a la superficie celular a través de interacciones de carga. Una observación sorprendente es que la "activación" de PAMAM por degradación parcial a través de hidrólisis mejora la eficiencia de transfección en 2-3 órdenes de magnitud, [23] proporcionando más evidencia que apoya la existencia de un complejo acoplado electrostáticamente. Se cree que la fragmentación de algunas ramas del dendrímero afloja la estructura general (menos enlaces amida y restricciones de espacio), lo que teóricamente daría como resultado un mejor contacto entre el dendrímero y el sustrato de ADN porque el dendrímero no se ve forzado a una conformación esférica rígida debido a la estérica . Esto a su vez da como resultado complejos de ADN más compactos que se endocitan más fácilmente. Después de la endocitosis, los complejos se someten a las condiciones ácidas del endosoma celular . Los dendrímeros PAMAM actúan como un amortiguador en este entorno, absorbiendo el exceso de protones con multitud de residuos de amina, lo que conduce a la inhibición de la actividad de la nucleasa endosómica dependiente del pH y, por lo tanto, protege el ADN de carga. Las aminas terciarias en el interior del dendrímero también pueden participar en la actividad amortiguadora, lo que hace que la molécula se hinche; además, a medida que los PAMAM adquieren cada vez más carga positiva, se requieren menos de ellos para la interacción óptima entre PAMAM y ADN, y los dendrímeros libres se liberan del complejo. La liberación y el hinchamiento del dendrímero pueden finalmente lisar el endosoma, lo que resulta en la liberación del ADN de carga. Los dendrímeros PAMAM activados tienen menos barrera espacial para la protonación de aminas en el interior, lo que se cree que es una fuente importante de su ventaja sobre los PAMAM no activados. [25]
En el contexto de los enfoques existentes para la transferencia de genes, los dendrímeros PAMAM ocupan una posición sólida en relación con las principales tecnologías clásicas, como la electroporación , la microinyección y los métodos virales . La electroporación, que implica la aplicación de pulsos eléctricos a través de las células para crear agujeros en la membrana a través de los cuales puede entrar el ADN, tiene efectos citotóxicos obvios y no es adecuada para aplicaciones in vivo . Por otro lado, la microinyección, el uso de agujas finas para inyectar físicamente material genético en el núcleo celular, ofrece un mayor control, pero es una tarea meticulosa y de alta habilidad en la que se puede transfectar un número relativamente bajo de células. Aunque los vectores virales pueden ofrecer una transfección altamente específica y de alta eficiencia, la generación de dichos virus es costosa y requiere mucho tiempo; además, la naturaleza viral inherente de la transferencia de genes a menudo desencadena una respuesta inmunitaria, lo que limita las aplicaciones in vivo . De hecho, muchas tecnologías de transfección modernas se basan en liposomas ensamblados artificialmente (tanto los liposomas como los PAMAM son macromoléculas con carga positiva). [25] Dado que los dendrímeros PAMAM y sus complejos con ADN presentan una baja citotoxicidad, una mayor eficiencia de transfección que los métodos basados en liposomas y son eficaces en una amplia gama de líneas celulares, [16] han ocupado un lugar importante en las metodologías modernas de terapia génica. La empresa de biotecnología Qiagen ofrece actualmente dos líneas de productos de transfección de ADN (SuperFect y PolyFect) basadas en la tecnología de dendrímeros PAMAM activados.
Queda mucho trabajo por delante antes de que los dendrímeros PAMAM activados puedan utilizarse como agentes de terapia génica in vivo . Aunque los dendrímeros han demostrado ser altamente eficientes y no tóxicos in vitro , la estabilidad, el comportamiento y el transporte del complejo de transfección en sistemas biológicos aún deben caracterizarse y optimizarse. Al igual que con las aplicaciones de administración de fármacos, la orientación específica del complejo de transfección es ideal y también debe explorarse.