Las helicasas son una clase de enzimas que se cree que son vitales para todos los organismos . Su función principal es descomprimir el material genético de un organismo . Las helicasas son proteínas motoras que se mueven direccionalmente a lo largo de una columna vertebral de fosfodiéster de ácido nucleico , separando dos cadenas de ácido nucleico hibridadas (de ahí helic- +-asa ), utilizando energía de la hidrólisis del ATP . Existen muchas helicasas, que representan la gran variedad de procesos en los que se debe catalizar la separación de hebras. Aproximadamente el 1% de los genes eucariotas codifican helicasas. [1]
El genoma humano codifica 95 helicasas no redundantes: 64 helicasas de ARN y 31 helicasas de ADN. [2] Muchos procesos celulares, como la replicación , transcripción , traducción , recombinación , reparación del ADN y biogénesis de ribosomas implican la separación de hebras de ácido nucleico que requiere el uso de helicasas. Algunas helicasas especializadas también participan en la detección de ácidos nucleicos virales durante la infección y cumplen una función inmunológica. Una helicasa es una enzima que desempeña un papel crucial en los procesos de replicación y reparación del ADN. Su función principal es desenrollar la molécula de ADN de doble hebra rompiendo los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases complementarias, permitiendo que las hebras de ADN se separen. Esto crea una bifurcación de replicación, que sirve como plantilla para sintetizar nuevas cadenas de ADN. La helicasa es un componente esencial de los mecanismos celulares que garantiza la replicación precisa del ADN y el mantenimiento de la información genética. La ADN helicasa cataliza la regresión. RecG y la enzima PriA trabajan juntas para rebobinar el ADN dúplex, creando una unión Holliday. RecG libera proteínas unidas y la helicasa PriA facilita la recarga del ADN para reanudar la replicación del ADN. RecG reemplaza la proteína de unión monocatenaria (SSB), que regula los sitios de carga de la helicasa-horquilla durante la regresión de la horquilla. La proteína SSB interactúa con las ADN helicasas PriA y RecG para recuperar las horquillas de replicación del ADN estancadas. Estas enzimas deben unirse a la SSB-helicasa para cargarse en las horquillas estancadas. El deslizamiento térmico y la unión dúplex de ADN posiblemente estén respaldados por el dominio de cuña de la asociación de RecG con el conector SSB. En una reacción de regresión facilitada por RecG y ATPHolliday se crean uniones para su posterior procesamiento.
Las helicasas se utilizan a menudo para separar hebras de una doble hélice de ADN o una molécula de ARN autohibridada utilizando la energía de la hidrólisis del ATP , un proceso caracterizado por la ruptura de enlaces de hidrógeno entre bases de nucleótidos hibridadas . También funcionan para eliminar proteínas asociadas a ácidos nucleicos y catalizar la recombinación de ADN homólogo . [3] Las helicasas facilitan los procesos metabólicos del ARN, como la traducción, la transcripción, la biogénesis de ribosomas , el empalme de ARN , el transporte de ARN, la edición de ARN y la degradación de ARN. [3] Las helicasas se mueven incrementalmente a lo largo de una cadena de ácido nucleico del dúplex con una direccionalidad y procesividad específicas de cada enzima en particular.
Las helicasas adoptan diferentes estructuras y estados de oligomerización . Mientras que las helicasas tipo DnaB desenrollan el ADN como hexámeros en forma de anillo , se ha demostrado que otras enzimas son activas como monómeros o dímeros . Los estudios han demostrado que las helicasas pueden actuar pasivamente, esperando que se produzca un desenrollado no catalizado y luego translocándose entre las hebras desplazadas, [4] o pueden desempeñar un papel activo en la catalización de la separación de las hebras utilizando la energía generada en la hidrólisis del ATP. [5] En el último caso, la helicasa actúa de manera comparable a un motor activo, desenrollándose y translocándose a lo largo de su sustrato como resultado directo de su actividad ATPasa. [6] Las helicasas pueden procesarse mucho más rápido in vivo que in vitro debido a la presencia de proteínas accesorias que ayudan en la desestabilización de la unión de la horquilla. [6]
La acción enzimática de la helicasa, como la desenrollación de ácidos nucleicos, se logra mediante la disminución de la barrera de activación ( ) de cada acción específica. [7] [5] [8] [9] La barrera de activación es el resultado de varios factores y se puede definir utilizando la siguiente ecuación, donde
= número de pares de bases desenrollados (pb),
= energía libre de formación de pares de bases,
= reducción de energía libre debido a la helicasa, y
= reducción de energía libre debido a las fuerzas de apertura.
Los factores que contribuyen a la altura de la barrera de activación incluyen: la secuencia de ácido nucleico específica de la molécula involucrada, el número de pares de bases involucradas, la tensión presente en la horquilla de replicación y las fuerzas de desestabilización. [7] [5] [8] [9]
El tamaño de la barrera de activación que debe superar la helicasa contribuye a su clasificación como helicasa activa o pasiva. En las helicasas pasivas, existe una barrera de activación significativa (definida como , donde es la constante de Boltzmann y la temperatura del sistema). Debido a esta importante barrera de activación, su progresión de desenrollamiento se ve afectada en gran medida por la secuencia de ácidos nucleicos dentro de la molécula a desenrollarse y la presencia de fuerzas desestabilizadoras que actúan sobre la horquilla de replicación. [7] [5] [8] [9] Ciertas combinaciones de ácidos nucleicos disminuirán las tasas de desenrollado (es decir, guanina y citosina ), mientras que varias fuerzas desestabilizadoras pueden aumentar la velocidad de desenrollado. [5] [8] [9] En sistemas pasivos, la tasa de desenrollado ( ) es menor que la tasa de translocación ( ) (translocación a lo largo del ácido nucleico monocatenario, ssNA), debido a su dependencia del desenredado transitorio de los pares de bases en la bifurcación de replicación para determinar su velocidad de desenrollado. [7] [5] [8] [9]
En las helicasas activas , donde el sistema carece de una barrera significativa, ya que la helicasa puede desestabilizar los ácidos nucleicos, desenrollando la doble hélice a un ritmo constante, independientemente de la secuencia del ácido nucleico. En las helicasas activas, está más cerca de , debido a la capacidad de la helicasa activa de desestabilizar directamente la horquilla de replicación para promover el desenrollado. [7] [5] [8] [9]
Las helicasas activas muestran un comportamiento similar cuando actúan sobre ambos ácidos nucleicos de doble hebra, dsNA o ssNA, en lo que respecta a las velocidades de desenrollado y translocación, siendo en ambos sistemas aproximadamente iguales.
Estas dos categorías de helicasas también pueden modelarse como mecanismos. En tales modelos, las helicasas pasivas se conceptualizan como trinquetes brownianos, impulsados por fluctuaciones térmicas y gradientes anisotrópicos posteriores a través de la red de ADN. Las helicasas activas, por el contrario, se conceptualizan como motores paso a paso, también conocidos como motores de carrera, que utilizan un "gusano de pulgada" conformacional o un mecanismo de "caminar" mano sobre mano para progresar. [10] Dependiendo del organismo, dicho progreso de recorrido de hélice puede ocurrir a velocidades de rotación en el rango de 5.000 [11] a 10.000 [12] RPM.
Las ADN helicasas se descubrieron en E. coli en 1976. Esta helicasa se describió como una "enzima desenrolladora de ADN" que "desnaturaliza los dúplex de ADN en una reacción dependiente de ATP, sin degradarse detectablemente". [13] La primera ADN helicasa eucariota descubierta fue en 1978 en la planta de lirio. [14] Desde entonces, las ADN helicasas fueron descubiertas y aisladas en otras bacterias, virus, levaduras, moscas y eucariotas superiores. [15] Hasta la fecha, se han aislado al menos 14 helicasas diferentes de organismos unicelulares, 6 helicasas de bacteriófagos, 12 de virus, 15 de levaduras, 8 de plantas, 11 de timo de ternera y aproximadamente 25 helicasas de células humanas. [16] A continuación se muestra una historia del descubrimiento de la helicasa:
La función común de las helicasas explica el hecho de que muestran un cierto grado de homología en la secuencia de aminoácidos ; todos poseen motivos de secuencia ubicados en el interior de su estructura primaria , involucrados en la unión de ATP , la hidrólisis de ATP y la translocación a lo largo del sustrato de ácido nucleico . La porción variable de la secuencia de aminoácidos está relacionada con las características específicas de cada helicasa.
La presencia de estos motivos de helicasa permite atribuir una supuesta actividad de helicasa a una proteína determinada, pero no necesariamente la confirma como una helicasa activa. Sin embargo, los motivos conservados apoyan una homología evolutiva entre enzimas. Basándose en estos motivos de helicasas, se han distinguido varias superfamilias de helicasas.
Las helicasas se clasifican en 6 grupos (superfamilias) según sus motivos de secuencia compartidos. [26] Las helicasas que no forman una estructura de anillo se encuentran en las superfamilias 1 y 2, y las helicasas que forman anillos forman parte de las superfamilias 3 a 6. [27] Las helicasas también se clasifican como α o β dependiendo de si funcionan con estructuras simples o dobles. cadena de ADN ; Las α helicasas trabajan con ADN monocatenario y las β helicasas trabajan con ADN bicatenario . También se clasifican por polaridad de translocación. Si la translocación ocurre en 3'-5', la helicasa es de tipo A; si la translocación ocurre 5'-3' es tipo B. [26]
Todas las helicasas son miembros de una familia que contiene bucles P o motivos de Walker .
El gen ATRX codifica la helicasa dependiente de ATP, ATRX (también conocida como XH2 y XNP) de la familia del subgrupo SNF2, que se cree que es responsable de funciones como la remodelación de la cromatina, la regulación genética y la metilación del ADN. [31] [32] [33] [34] Estas funciones ayudan en la prevención de la apoptosis, lo que resulta en la regulación del tamaño cortical, así como una contribución a la supervivencia del hipocampo y las estructuras corticales, lo que afecta la memoria y el aprendizaje. [31] Esta helicasa se encuentra en el cromosoma X (Xq13.1-q21.1), en la heterocromatina pericentromérica y se une a la proteína heterocromatina 1 . [31] [33] Los estudios han demostrado que ATRX desempeña un papel en la metilación del ADNr y es esencial para el desarrollo embrionario. [35] Se han encontrado mutaciones en toda la proteína ATRX , y más del 90% de ellas están ubicadas en los dominios de dedo de zinc y helicasa. [36] Las mutaciones de ATRX pueden provocar retraso mental alfa-talasemia ligada al cromosoma X ( síndrome ATR-X ). [31]
Se ha descubierto que varios tipos de mutaciones encontradas en ATRX están asociadas con ATR-X, incluidas las más comúnmente mutaciones sin sentido de una sola base, así como mutaciones sin sentido, de cambio de marco y de deleción. [34] Las características de ATR-X incluyen: microcefalia, anomalías esqueléticas y faciales, retraso mental, anomalías genitales, convulsiones, uso y capacidad del lenguaje limitados y alfa-talasemia. [31] [35] [32] El fenotipo observado en ATR-X sugiere que la mutación del gen ATRX causa la regulación negativa de la expresión genética, como los genes de alfa-globina. [32] Aún se desconoce qué causa la expresión de las diversas características de ATR-X en diferentes pacientes. [35]
XPD (factor D de Xeroderma pigmentoso, también conocido como proteína ERCC2) es una helicasa 5'-3', superfamilia II, dependiente de ATP, que contiene dominios de grupo hierro-azufre. [26] [37] Se ha demostrado que las mutaciones puntuales hereditarias en la helicasa XPD están asociadas con trastornos de envejecimiento acelerado como el síndrome de Cockayne (CS) y la tricotiodistrofia (TTD). [38] El síndrome de Cockayne y la tricotiodistrofia son trastornos del desarrollo que involucran sensibilidad a la luz ultravioleta y envejecimiento prematuro, y el síndrome de Cockayne exhibe un retraso mental severo desde el momento del nacimiento. [38] La mutación de la helicasa XPD también se ha implicado en el xeroderma pigmentoso (XP), un trastorno caracterizado por la sensibilidad a la luz ultravioleta y que resulta en un aumento de 1000 veces en el desarrollo de cáncer de piel. [38]
XPD es un componente esencial del complejo TFIIH , un factor de transcripción y reparación en la célula. [38] [39] [40] [41] [42] Como parte de este complejo, facilita la reparación por escisión de nucleótidos al desenrollar el ADN. [38] TFIIH ayuda a reparar el ADN dañado, como el daño solar. [38] [39] [40] [41] [42] Una mutación en la helicasa XPD que ayuda a formar este complejo y contribuye a su función causa la sensibilidad a la luz solar que se observa en las tres enfermedades, así como el mayor riesgo de cáncer. observado en XP y envejecimiento prematuro observado en tricotiodistrofia y síndrome de Cockayne. [38]
Las mutaciones de la helicasa XPD que conducen a la tricotiodistrofia se encuentran en toda la proteína en varios lugares involucrados en las interacciones proteína-proteína. [38] Esta mutación da como resultado una proteína inestable debido a su incapacidad para formar interacciones estabilizadoras con otras proteínas en los puntos de mutación. [38] Esto, a su vez, desestabiliza todo el complejo TFIIH, lo que conduce a defectos en los mecanismos de transcripción y reparación de la célula. [38]
Se ha sugerido que las mutaciones de la helicasa XPD que conducen al síndrome de Cockayne podrían ser el resultado de mutaciones dentro de XPD, causando rigidez de la proteína y la posterior incapacidad para cambiar de funciones de reparación a funciones de transcripción debido a un "bloqueo" en el modo de reparación. [38] Esto podría hacer que la helicasa corte segmentos de ADN destinados a la transcripción. [38] Aunque la evidencia actual apunta a un defecto en la helicasa XPD que resulta en una pérdida de flexibilidad en la proteína en los casos de síndrome de Cockayne, aún no está claro cómo esta estructura proteica conduce a los síntomas descritos en el síndrome de Cockayne. [38]
En la xerodermia pigmentosa, la mutación XPD helicasa existe en el sitio de unión del ATP o del ADN. [38] Esto da como resultado una helicasa estructuralmente funcional capaz de facilitar la transcripción, sin embargo, inhibe su función en el desenrollado del ADN y la reparación del ADN. [38] La falta de capacidad de una célula para reparar mutaciones, como las causadas por el daño solar, es la causa de la alta tasa de cáncer en pacientes con xeroderma pigmentosa.
Las helicasas RecQ (3'-5') pertenecen al grupo de helicasas de la Superfamilia II, que ayudan a mantener la estabilidad del genoma y suprimen la recombinación inapropiada. [43] [44] Las deficiencias y/o mutaciones en las helicasas de la familia RecQ muestran una recombinación genética y/o una replicación del ADN aberrantes, lo que conduce a inestabilidad cromosómica y a una disminución general de la capacidad de proliferar. [43] Se ha demostrado que las mutaciones en las helicasas BLM, RECQL4 y WRN de la familia RecQ, que desempeñan un papel en la regulación de la recombinación homóloga, dan como resultado las enfermedades autosómicas recesivas síndrome de Bloom (BS), síndrome de Rothmund-Thomson (RTS) y síndrome de Werner. síndrome (WS), respectivamente. [44] [45]
El síndrome de Bloom se caracteriza por una predisposición al cáncer de aparición temprana, con una edad media de aparición de 24 años. [44] [46] Los pacientes con síndrome de células de Bloom muestran una alta frecuencia de intercambio recíproco entre cromátidas hermanas (SCE) y daño cromosómico excesivo. [47] Hay evidencia que sugiere que BLM desempeña un papel en el rescate de la replicación interrumpida del ADN en las bifurcaciones de replicación. [47]
El síndrome de Werner es un trastorno del envejecimiento prematuro, con síntomas que incluyen la aparición temprana de aterosclerosis y osteoporosis y otras enfermedades relacionadas con la edad, una alta incidencia de sarcoma y la muerte que a menudo ocurre por infarto de miocardio o cáncer entre la cuarta y sexta década de la vida. [44] [48] Las células de los pacientes con síndrome de Werner exhiben una vida reproductiva reducida con roturas y translocaciones cromosómicas, así como grandes deleciones de componentes cromosómicos, lo que causa inestabilidad genómica. [48]
El síndrome de Rothmund-Thomson, también conocido como poiquilodermia congénita , se caracteriza por envejecimiento prematuro, anomalías cutáneas y esqueléticas, erupción cutánea, poiquilodermia , cataratas juveniles y predisposición a cánceres como los osteosarcomas. [44] [49] Se encuentran reordenamientos cromosómicos que causan inestabilidad genómica en las células de pacientes con síndrome de Rothmund-Thomson. RecQ es una familia de enzimas ADN helicasa que se encuentran en varios organismos, incluidas bacterias, arqueas y eucariotas (como los humanos). Estas enzimas desempeñan funciones importantes en el metabolismo del ADN durante la replicación, recombinación y reparación del ADN. Hay cinco proteínas helicasa RecQ conocidas en humanos: RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 y RecQ5. Las mutaciones en algunos de estos genes están asociadas con trastornos genéticos. Por ejemplo, las mutaciones en el gen BLM causan el síndrome de Bloom, que se caracteriza por un mayor riesgo de cáncer y otros problemas de salud. [50] Las mutaciones en el gen WRN conducen al síndrome de Werner, una afección caracterizada por envejecimiento prematuro y un mayor riesgo de enfermedades relacionadas con la edad. Las helicasas RecQ son cruciales para mantener la estabilidad e integridad genómica. Ayudan a prevenir la acumulación de anomalías genéticas que pueden provocar enfermedades como el cáncer. La integridad del genoma depende de la familia de ADN helicasa RecQ, que incluye procesos de reparación, recombinación, replicación y transcripción del ADN. La inestabilidad del genoma y el envejecimiento prematuro son condiciones que surgen de mutaciones en las helicasas RecQ humanas. [51] Falta la helicasa RecQ Sgs1 en las células de levadura, lo que las convierte en modelos útiles para comprender las anomalías de las células humanas y la función de la helicasa RecQ. [52] El miembro de la familia RecQ helicasa, RECQ1, está relacionado con un pequeño número de trastornos genéticos poco comunes del cáncer en individuos. Participa en la transcripción, el ciclo celular y la reparación del ADN. Según una investigación reciente, las mutaciones sin sentido en el gen RECQ1 pueden desempeñar un papel en el desarrollo del cáncer de mama familiar. Las ADN helicasas con frecuencia se sienten atraídas por regiones dañadas del ADN y son esenciales para la replicación, recombinación, reparación y transcripción del ADN celular. La manipulación química de sus procesos moleculares puede cambiar la velocidad a la que se dividen las células cancerosas, así como la eficiencia de las transacciones y la homeostasis celular. El atrapamiento de las ADN helicasas, un tipo de proteína metabólica del ADN, inducido por moléculas pequeñas, puede tener consecuencias nocivas en las células cancerosas que proliferan rápidamente, lo que podría ser eficaz en el tratamiento del cáncer.
Durante la meiosis, las roturas de la doble cadena del ADN y otros daños en el ADN de una cromátida se reparan mediante recombinación homóloga utilizando la cromátida hermana o una cromátida no hermana homóloga como plantilla. Esta reparación puede dar como resultado un recombinante cruzado (CO) o, más frecuentemente, un no cruzado (NCO). En la levadura Schizosaccharomyces pombe, la ADN helicasa FmI1 de la familia FANCM dirige la formación de recombinación de NCO durante la meiosis. [53] La helicasa Rqh1 de tipo RecQ también dirige la recombinación meiótica de NCO. [54] Estas helicasas, a través de su capacidad para desenrollar intermediarios del bucle D , promueven la recombinación de NCO mediante el proceso de recocido de hebras dependiente de la síntesis .
En la planta Arabidopsis thaliana , la helicasa FANCM promueve NCO y antagoniza la formación de CO recombinantes. [55] Otra helicasa, RECQ4A/B, también reduce de forma independiente los CO. Se sugirió que los CO están restringidos debido a los costos a largo plazo de la recombinación del CO, es decir, la ruptura de combinaciones genéticas favorables de alelos acumuladas por la selección natural pasada . [55]
Las ARN helicasas son esenciales para la mayoría de los procesos del metabolismo del ARN, como la biogénesis de ribosomas , el empalme del pre-ARNm y el inicio de la traducción . También desempeñan un papel importante en la detección de ARN virales. [56] Las ARN helicasas participan en la mediación de la respuesta inmune antiviral porque pueden identificar ARN extraños en los vertebrados. Aproximadamente el 80% de todos los virus son virus de ARN y contienen sus propias helicasas de ARN. [57] Las ARN helicasas defectuosas se han relacionado con cánceres, enfermedades infecciosas y trastornos neurodegenerativos. [56] Algunos trastornos neurológicos asociados con helicasas de ARN defectuosas son: esclerosis lateral amiotrófica , atrofia muscular espinal , ataxia espinocerebelosa tipo 2 , enfermedad de Alzheimer y síndrome de contractura congénita letal . [57]
Las ARN helicasas y las ADN helicasas se pueden encontrar juntas en todas las superfamilias de helicasas excepto SF6. [58] [59] Todas las ARN helicasas eucariotas que se han identificado hasta la fecha no forman anillos y son parte de SF1 y SF2. Por otro lado, se han encontrado ARN helicasas formadoras de anillos en bacterias y virus. [56] Sin embargo, no todas las ARN helicasas exhiben actividad helicasa definida por la función enzimática, es decir, proteínas de la familia Swi/Snf. Aunque estas proteínas portan los motivos típicos de helicasa, hidrolizan ATP de una manera dependiente del ácido nucleico y están construidas alrededor de un núcleo de helicasa, en general no se observa actividad de desenrollado. [60]
Las ARN helicasas que exhiben actividad de desenrollado se han caracterizado por al menos dos mecanismos diferentes: desenrollado dúplex canónico y separación local de hebras. El desenrollado dúplex canónico es la separación direccional por pasos de una hebra dúplex, como se describió anteriormente, para el desenrollado del ADN. Sin embargo, la separación local de las cadenas se produce mediante un proceso en el que la enzima helicasa se carga en cualquier lugar a lo largo del dúplex. Esto suele ser ayudado por una región monocatenaria del ARN, y la carga de la enzima va acompañada de la unión de ATP. [61] Una vez que la helicasa y el ATP se unen, se produce una separación local de las cadenas, lo que requiere la unión del ATP pero no el proceso real de hidrólisis del ATP. [62] Presentado con menos pares de bases, el dúplex luego se disocia sin más ayuda de la enzima. Este modo de desenrollado es utilizado por las helicasas de caja DEAD/DEAH . [63]
Actualmente hay disponible en línea una base de datos de ARN helicasas [64] que contiene una lista completa de ARN helicasas con información como secuencia, estructura y funciones bioquímicas y celulares. [56]
Se utilizan varios métodos para medir la actividad de la helicasa in vitro . Estos métodos van desde ensayos cualitativos (ensayos que generalmente implican resultados que no involucran valores o mediciones) hasta cuantitativos (ensayos con resultados numéricos que pueden utilizarse en análisis estadísticos y numéricos). En 1982-1983, se desarrolló el primer ensayo bioquímico directo para medir la actividad de la helicasa. [15] [65] Este método se denominó "ensayo de desplazamiento de hebras".
Posteriormente se desarrollaron otros métodos que incorporaban algunos, si no todos, de los siguientes: mecánica de alto rendimiento, uso de marcaje de nucleótidos no radiactivos, tiempo de reacción más rápido/menos consumo de tiempo, monitoreo en tiempo real de la actividad de la helicasa (usando medición cinética en su lugar). de análisis de punto final/punto único). Estas metodologías incluyen: "un método de flujo de extinción rápida, ensayos basados en fluorescencia, ensayos de filtración, un ensayo de centelleo por proximidad , un ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo , un ensayo basado en tecnología de placa flash, ensayos de extinción de fluorescencia homogénea con resolución temporal y electroquimioluminiscencia". -ensayos de helicasa basados en ". [16] Con el uso de ecuaciones matemáticas especializadas, algunos de estos ensayos se pueden utilizar para determinar cuántos nucleótidos de pares de bases puede romper una helicasa por hidrólisis de 1 molécula de ATP. [66]
También se encuentran disponibles kits de diagnóstico disponibles comercialmente. Uno de esos kits es el ensayo de diagnóstico "Trupoint" de PerkinElmer , Inc. Este ensayo es un ensayo de extinción de fluorescencia resuelta en el tiempo que utiliza la tecnología "SignalClimb" de PerkinElmer que se basa en dos etiquetas que se unen muy próximas entre sí pero en direcciones opuestas. Hebras de ADN. Una etiqueta es un quelato de lantánido fluorescente, que sirve como etiqueta que se monitorea a través de un lector de placas de 96/384 pocillos adecuado. La otra etiqueta es una molécula extintora orgánica. La base de este ensayo es la "extinción" o represión de la señal del quelato de lantánido por parte de la molécula extintora orgánica cuando las dos están muy próximas, como lo serían cuando el dúplex de ADN está en su estado nativo. Tras la actividad de la helicasa en el dúplex, los marcadores del extintor y de los lantánidos se separan a medida que se desenrolla el ADN. Esta pérdida de proximidad anula la capacidad de los extintores para reprimir la señal de los lantánidos, provocando un aumento detectable en la fluorescencia que es representativo de la cantidad de ADN desenrollado y puede usarse como una medida cuantificable de la actividad de la helicasa. La ejecución y uso de técnicas de imágenes de fluorescencia de una sola molécula, centrándose en métodos que incluyen captura óptica junto con imágenes epifluorescentes, y también inmovilización de superficies junto con visualización de fluorescencia de reflexión interna total. Combinado con células de flujo de microcanales y control de microfluidos, permite obtener imágenes y rastrear moléculas de ADN y proteínas marcadas fluorescentemente, lo que permite medir el desenrollado y la translocación del ADN con una resolución de una sola molécula. [67]
La polaridad de la helicasa, que también se considera "direccionalidad", se define como la dirección (caracterizada como 5'→3' o 3'→5') del movimiento de la helicasa en la cadena sencilla de ADN/ARN a lo largo de la cual se mueve. Esta determinación de la polaridad es vital en f.ex. determinar si la helicasa analizada se une a la cadena principal del ADN o a la cadena rezagada del ADN. Para caracterizar esta característica de helicasa, se utiliza un ADN parcialmente dúplex como sustrato que tiene una región central de ADN monocatenario con diferentes longitudes de regiones dúplex de ADN (una región corta que corre 5'→3' y una región más larga que corre 3 '→5') en ambos lados de esta región. [68] Una vez que se agrega la helicasa a esa región monocatenaria central, la polaridad se determina mediante la caracterización del ADN monocatenario recién formado.
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