Kaede es una proteína fluorescente fotoactivable que se origina naturalmente a partir de un coral pétreo , Trachyphyllia geoffroyi . Su nombre significa "arce" en japonés . Con la irradiación de luz ultravioleta (350–400 nm), Kaede sufre una fotoconversión irreversible de fluorescencia verde a fluorescencia roja.
Kaede es una proteína homotetramérica con un tamaño de 116 kDa . La estructura tetramérica se dedujo porque su estructura primaria es de sólo 28 kDa. Esta tetramerización posiblemente haga que Kaede tenga una baja tendencia a formar agregados cuando se fusiona con otras proteínas.
La propiedad de la proteína Kaede de fluorescencia fotoconvertida fue descubierta por casualidad y reportada por primera vez por Ando et al. en Actas de la Academia Nacional de Ciencias de Estados Unidos . [1] Se descubrió que una alícuota de proteína Kaede emitía fluorescencia roja después de dejarla en el banco y exponerla a la luz solar. La verificación posterior reveló que Kaede, que originalmente era verde fluorescente, después de la exposición a la luz ultravioleta se fotoconvierte y se vuelve rojo fluorescente. Luego se llamó Kaede.
La propiedad de fotoconversión en Kaede la aporta el tripéptido His 62 - Tyr 63 - Gly 64 , que actúa como un cromóforo verde que puede convertirse en rojo. [2] Una vez que se sintetiza Kaede, un cromóforo, 4-(p-hidroxibenciliden)-5-imidazolinona, derivado del tripéptido media la fluorescencia verde en Kaede. Cuando se expone a los rayos UV, la proteína Kaede sufre una escisión no convencional entre el nitrógeno amida y el carbono α (Cα) en His62 mediante una reacción formal de eliminación β. Seguida de la formación de un doble enlace entre His62-Cα y –Cβ, la conjugación π se extiende al anillo de imidazol de His62. Se forma un nuevo cromóforo, 2-[(1E)-2-(5-imidazolil)etenil]-4-(p-hidroxibenciliden)-5-imidazolinona, con la propiedad de emitir rojo.
La escisión del tripéptido se analizó mediante análisis SDS-PAGE. Kaede verde no convertido muestra una banda a 28 kDa, mientras que se observan dos bandas a 18 kDa y 10 kDa para Kaede rojo convertido, lo que indica que la escisión es crucial para la fotoconversión. [ cita necesaria ]
Un desplazamiento del espectro de absorción y emisión en Kaede es causado por la escisión del tripéptido. Antes de la fotoconversión, Kaede muestra un máximo de longitud de onda de absorción importante a 508 nm, acompañado de un ligero hombro a 475 nm. Cuando se excita a 480 nm, se emite fluorescencia verde con un pico de 518 nm. Cuando Kaede se irradia con luz ultravioleta o violeta, el pico de absorción principal cambia a 572 nm. Cuando se excitó a 540 nm, Kaede mostró un máximo de emisión a 582 nm con un hombro a 627 nm y un pico de 518 nm. Después de esta fotoconversión se emite fluorescencia roja.
La fotoconversión en Kaede es irreversible. La exposición en la oscuridad o la iluminación a 570 nm no pueden restaurar su fluorescencia verde original. Se observa una fluorescencia reducida en Kaede rojo fotoconvertido cuando se expone intensamente a luz de 405 nm, seguida de una recuperación parcial después de varios minutos.
Como todas las demás proteínas fluorescentes, Kaede puede ser un marcador óptico regional para la expresión genética y el etiquetado de proteínas para el estudio del comportamiento celular. [3]
Una de las aplicaciones más útiles es la visualización de neuronas . La delimitación de una neurona individual es difícil debido a los procesos largos y delgados que se entrelazan con otras neuronas. Incluso cuando las neuronas cultivadas están marcadas con proteínas fluorescentes, siguen siendo difíciles de identificar individualmente debido al denso paquete.
En el pasado, dicha visualización se podía realizar de manera convencional llenando las neuronas con amarillo de Lucifer o sulforodamina, que es una técnica laboriosa.[1] Después del descubrimiento de la proteína Kaede, se descubrió que era útil para delimitar neuronas individuales. Las neuronas se transfectan con ADNc de la proteína Kaede y se irradian con luz ultravioleta. La proteína Kaede roja fotoconvertida tiene libre difusibilidad en la célula excepto en el núcleo, y se propaga por toda la célula, incluidas las dendritas y el axón. Esta técnica ayuda a desenmarañar las complejas redes establecidas en una cultura densa. Además, al etiquetar neuronas con diferentes colores mediante irradiación UV con diferentes tiempos de duración, se pueden visualizar los sitios de contacto entre las neuronas de interés rojas y verdes. [1]
La capacidad de visualización de células individuales es también una herramienta poderosa para identificar la morfología precisa y los comportamientos migratorios de células individuales dentro de cortes corticales vivos. Mediante la proteína Kaede, se puede seguir un par particular de células hijas en células vecinas positivas para Kaede en la zona ventricular de cortes de cerebro de ratón . Se visualizan los límites célula-célula de las células hijas y se puede describir la posición y distancia entre dos o más células. [4]
Como el cambio del color fluorescente es inducido por la luz ultravioleta, el marcado de células y estructuras subcelulares es eficaz incluso cuando sólo se induce una fotoconversión parcial.
Debido a la propiedad especial de la fluorescencia fotoconmutable, la proteína Kaede posee varias ventajas como marcador celular óptico .
Después de la fotoconversión, la proteína Kaede fotoconvertida emite una fluorescencia roja brillante y estable. Esta fluorescencia puede durar meses sin condiciones anaeróbicas. Como este estado rojo de Kaede es brillante y estable en comparación con el estado verde, y debido a que el Kaede verde no convertido emite una intensidad muy baja de fluorescencia roja, las señales rojas proporcionan contraste. [1]
Además, antes de la fotoconversión, Kaede emite una fluorescencia verde brillante que permite visualizar la localización de la proteína no fotoactivada. Esto es superior a otras proteínas fluorescentes como PA-GFP y KFP1, que solo muestran una baja fluorescencia antes de la fotoactivación. [3]
Además, como la fluorescencia verde y roja de Kaede se excita con luz azul a 480 nm para la observación, esta luz no inducirá la fotoconversión. Por lo tanto, las luces de iluminación para observación y fotoconversión se pueden separar completamente.
A pesar de la utilidad en el seguimiento y visualización de células de Kaede, existen algunas limitaciones. Aunque Kaede cambiará a rojo tras la exposición a luz ultravioleta o violeta y mostrará un aumento de 2000 veces en la relación de fluorescencia rojo-verde, el uso de bandas de fluorescencia tanto roja como verde puede causar problemas en experimentos con múltiples etiquetas. La tetramerización de Kaede puede alterar la localización y el tráfico de proteínas de fusión. Esto limita la utilidad de Kaede como etiqueta de proteína de fusión .
La propiedad de fotoconversión de Kaede no sólo contribuye a su aplicación en el etiquetado de proteínas y el seguimiento celular, sino que también es responsable de la gran variación en el color de los corales pétreos, Trachyphyllia geoffroyi . Bajo la luz del sol, debido a la fotoconversión de Kaede, los tentáculos y los discos se volverán rojos. A medida que Kaede verde fluorescente se sintetiza continuamente, estos corales vuelven a aparecer verdes a medida que se crea más Kaede no convertido. Debido a la diferente proporción de Kaede fotoconvertidos y no convertidos, se encuentra una gran diversidad de colores en los corales.
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