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Glutamina sintetasa

La glutamina sintetasa ( GS ) ( EC 6.3.1.2) [3] es una enzima que desempeña un papel esencial en el metabolismo del nitrógeno al catalizar la condensación de glutamato y amoníaco para formar glutamina :

Glutamato + ATP + NH 3 → Glutamina + ADP + fosfato

Reacción de la glutamina sintetasa.
Reacción catalizada por la glutamina sintetasa

La glutamina sintetasa utiliza el amoníaco producido por la reducción de nitrato, la degradación de aminoácidos y la fotorrespiración . [4] El grupo amida del glutamato es una fuente de nitrógeno para la síntesis de metabolitos de la vía de la glutamina . [5]

Otras reacciones pueden tener lugar a través de la GS. La competencia entre el ion amonio y el agua, sus afinidades de unión y la concentración del ion amonio influyen en la síntesis de glutamina y la hidrólisis de glutamina. La glutamina se forma si un ion amonio ataca al intermediario acil-fosfato, mientras que el glutamato se rehace si el agua ataca al intermediario. [6] [7] El ion amonio se une más fuertemente que el agua a la GS debido a las fuerzas electrostáticas entre un catión y una cavidad cargada negativamente. [4] Otra posible reacción es la unión del NH 2 OH a la GS, en lugar de al NH 4 +, lo que produce γ-glutamilhidroxamato. [6] [7]

Estructura

Dodecamara GS
Glutamina sintetasa, 12 subunidades [1]

La glutamina sintetasa puede estar compuesta por 8, 10 o 12 subunidades idénticas separadas en dos anillos cara a cara. [6] [8] [9] [10] Las GS bacterianas son dodecámeros con 12 sitios activos entre cada monómero . [6] Cada sitio activo crea un "túnel" que es el sitio de tres sitios de unión de sustrato distintos: nucleótido , ion amonio y aminoácido. [4] [6] [10] [11] El ATP se une a la parte superior del biembudo que se abre a la superficie externa de la GS. [4] El glutamato se une en la parte inferior del sitio activo. [7] El medio del biembudo contiene dos sitios en los que se unen cationes divalentes (Mn+2 o Mg+2). Un sitio de unión de cationes está involucrado en la transferencia de fosforilo de ATP a glutamato, mientras que el segundo estabiliza la GS activa y ayuda con la unión del glutamato. [6]

Los enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas mantienen unidos los dos anillos de GS. Cada subunidad posee un extremo C y un extremo N en su secuencia. El extremo C (tanga helicoidal) estabiliza la estructura de GS insertándose en la región hidrofóbica de la subunidad del otro anillo. El extremo N está expuesto al solvente. Además, el canal central está formado por seis láminas β de cuatro cadenas compuestas de bucles antiparalelos de las doce subunidades. [6]

Mecanismo

La GS cataliza la condensación dependiente de ATP del glutamato con amoníaco para producir glutamina. [4] La hidrólisis del ATP impulsa [8] el primer paso de un mecanismo concertado de dos partes. [4] [6] El ATP fosforila el glutamato para formar ADP y un intermediario de fosfato de acilo, el fosfato de γ-glutamil, que reacciona con el amoníaco y forma glutamina y fosfato inorgánico. El ADP y el Pi no se disocian hasta que el amoníaco se une y se libera la glutamina. [6]

El ATP se une primero a la parte superior del sitio activo cerca de un sitio de unión de cationes, mientras que el glutamato se une cerca del segundo sitio de unión de cationes en la parte inferior del sitio activo. [5] [7] La ​​presencia de ADP provoca un cambio conformacional en GS que estabiliza la fracción de fosfato de γ-glutamil. El amonio se une fuertemente a GS solo si está presente el intermediario acil-fosfato. El amonio, en lugar del amoníaco, se une a GS porque el sitio de unión es polar y está expuesto al solvente. [7] En el segundo paso, la desprotonación del amonio permite que el amoníaco ataque al intermediario desde su sitio cercano para formar glutamina. [12] El fosfato sale por la parte superior del sitio activo, mientras que la glutamina sale por la parte inferior (entre dos anillos). [13] [7]

Dos vistas de la glutamina sintetasa PDB ID: 1FPY

Función biológica

La GS está presente predominantemente en el cerebro, los riñones y el hígado. [4] [10] La GS en el cerebro participa en la regulación metabólica del glutamato, la desintoxicación del amoníaco cerebral, la asimilación del amoníaco, la reciclación de los neurotransmisores y la terminación de las señales de los neurotransmisores. [4] [14] La GS, en el cerebro, se encuentra principalmente en los astrocitos . [15] Los astrocitos protegen a las neuronas contra la excitotoxicidad al absorber el exceso de amoníaco y glutamato. [14] En entornos hiperamonémicos (niveles altos de amoníaco), se produce hinchazón astroglial. [14] [16] [17] Diferentes perspectivas han abordado el problema de la hinchazón astroglial. Un estudio muestra que ocurren cambios morfológicos que aumentan la expresión de GS en áreas glutamatérgicas u otras adaptaciones que alivian los altos niveles de glutamato y amoníaco. [14] Otra perspectiva es que la hinchazón de los astrocitos se debe a la acumulación de glutamina. Para prevenir el aumento de los niveles de glutamato cortical y del contenido de agua cortical, se realizó un estudio para prevenir la actividad de GS en ratas mediante el uso de MSO. [16]

Clases

Parece haber tres clases diferentes de GS: [18] [19] [20]

Las plantas tienen dos o más isoenzimas de GSII, una de las cuales se transloca al cloroplasto . Otra forma es citosólica . La traducción del gen GS citosólico está regulada por su región no traducida (UTR) 5', mientras que su UTR 3' desempeña un papel en el recambio de la transcripción. [23]

Si bien las tres clases de GS están claramente relacionadas estructuralmente, las similitudes de secuencia no son tan extensas.

Regulación e inhibición

La GS está sujeta a una modificación covalente reversible. Tyr 397 de las 12 subunidades puede sufrir adenililación o deadenilación por la adenilil transferasa (AT), una enzima reguladora bifuncional. [25] La adenililación es una modificación postraduccional que implica la unión covalente de AMP a una cadena lateral de proteína. Cada adenililación requiere un ATP y la inhibición completa de GS requiere 12 ATP. La deadenilación por AT implica la eliminación fosforolítica de los grupos adenililo unidos a Tyr como ADP . La actividad de AT está influenciada por la proteína reguladora que está asociada con ella: P II , un trímero de 44 kD . [25] P II también sufre una modificación postraduccional por la uridil transferasa , por lo que P II tiene dos formas. El estado de P II dicta la actividad de la adenilil transferasa. Si P II no está uridililado, entonces tomará la forma P IIA . El complejo AT:P IIA desactivará GS por adenililación. Si P II está uridilado, entonces tomará la forma P IID . El complejo AT:P IID activará GS por desadenilación. [25] Los complejos AT:P IIA y AT:P IID están regulados alostéricamente de manera recíproca por α-cetoglutarato (α-KG) y glutamina (Gln). Gln activará la actividad de AT:P IIA e inhibirá AT:P IID , lo que conduce a la adenililación y la posterior desactivación de GS. Además, Gln favorece la conversión de P IID a P IIA . Los efectos de α-KG sobre los complejos son opuestos. [25] En la mayoría de las bacterias gramnegativas, GS puede modificarse por adenililación (algunas cianobacterias y algas verdes o excepciones). [26]

La inhibición de la GS se ha centrado en gran medida en los ligandos del sitio amino. [6] Otros inhibidores son el resultado del metabolismo de la glutamina: triptófano, histidina, carbamoil fosfato, glucosamina-6-fosfato, trifosfato de citidina (CTP) y monofosfato de adenosina (AMP). [5] [8] [27] Otros inhibidores/reguladores son la glicina y la alanina. La alanina, la glicina y la serina se unen al sitio del sustrato del glutamato. El GDP, el AMP y el ADP se unen al sitio del ATP. [6] La L-serina, la L-alanina y la glicina se unen al sitio del L-glutamato en la GS no denilada. Los cuatro aminoácidos se unen al sitio por sus átomos comunes, "la cadena principal" de aminoácidos. [5] El glutamato es otro producto del metabolismo de la glutamina; sin embargo, el glutamato es un sustrato para la GS, lo que la inhibe para que actúe como regulador de la GS.2 Cada inhibidor puede reducir la actividad de la enzima; Una vez que todos los metabolitos finales de glutamina se unen a GS, la actividad de GS se inhibe casi por completo. [8] Muchas señales de entrada inhibitorias permiten un ajuste fino de GS al reflejar los niveles de nitrógeno en el organismo.

La regulación por retroalimentación distingue entre dos tipos eucariotas de GS: tejidos cerebrales y no cerebrales. Los GS no cerebrales responden a la inhibición por retroalimentación del producto final, mientras que los GS cerebrales no lo hacen. [6] Las altas concentraciones de metabolitos dependientes de glutamina deberían inhibir la actividad de GS, mientras que las bajas concentraciones deberían activarla. [6]

La sulfoximina de metionina actúa como inhibidor del sitio de unión del glutamato

Inhibidores:

La investigación sobre E. coli reveló que la GS se regula a través de la expresión génica. El gen que codifica la subunidad GS se denomina glnA . La transcripción de glnA depende de NR I (un potenciador transcripcional específico ). La transcripción activa ocurre si NR I está en su forma fosforilada, denominada NR I -P . La fosforilación de NR I es catalizada por NR II , una proteína quinasa . Si NR II forma un complejo con P IIA , funcionará como una fosfatasa y NR I -P se convertirá nuevamente en NR I. En este caso, la transcripción de glnA cesa. [25]

GS está sujeto a mecanismos reguladores completamente diferentes en las cianobacterias . [28] En lugar del sistema común de dos componentes NtrC-NtrB, [29] [30] las cianobacterias albergan el regulador transcripcional NtcA que está restringido a este clado y controla la expresión de GS y una multitud de genes involucrados en el metabolismo del nitrógeno . [31] [32] Además, GS en cianobacterias no se modifica covalentemente para aumentar la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación. [30] En cambio, GS en cianobacterias es inhibido por pequeñas proteínas, denominadas factores inactivadores de GS (IF) cuya transcripción está regulada negativamente por NtcA. [33] [34] Estos factores inactivadores están regulados además por diferentes ARN no codificantes : el sRNA NsiR4 interactúa con el 5'UTR del ARNm del factor inactivador de GS IF7 ( ARNm gifA ) y reduce su expresión. La expresión de NsiR4 está bajo el control positivo del factor de transcripción de control de nitrógeno NtcA. [35] Además, la expresión del factor inactivador de GS IF17 está controlada por un riboswitch que se une a la glutamina . [36]

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