El experimento de Luria-Delbrück (1943) (también llamado el Test de Fluctuación ) demostró que en las bacterias las mutaciones genéticas surgen en ausencia de presión selectiva en lugar de ser una respuesta a ella. Por lo tanto, concluyó que la teoría de Darwin de la selección natural que actúa sobre mutaciones aleatorias se aplica tanto a las bacterias como a organismos más complejos. Max Delbrück y Salvador Luria ganaron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1969 en parte por este trabajo.
Supongamos que se introduce una sola bacteria en un medio de cultivo rico en nutrientes y se la deja crecer durante el tiempo que duplica su tiempo de crecimiento; obtendremos descendencia. Luego, introducimos un desafío con bacteriófagos. Esto mataría a la mayoría de las bacterias, pero dejaría algunas con vida. Luego podemos untar el medio de cultivo sobre un nuevo medio de cultivo y contar el número de colonias como el número de sobrevivientes.
En el escenario lamarckiano, cada bacteria se enfrenta al desafío sola. La mayoría perecería, pero unas pocas sobrevivirían a la prueba y fundarían una nueva colonia. En el escenario darwiniano, la resistencia al fago se produciría aleatoriamente durante la replicación. Las que heredaran la resistencia sobrevivirían, mientras que las que no la heredaran morirían.
En el escenario lamarckiano, asumiendo que cada bacteria tiene una probabilidad igualmente pequeña de supervivencia, entonces el número de nuevas colonias se distribuye según un patrón de Poisson, que decae exponencialmente ante un gran número de sobrevivientes.
En el escenario darwiniano, asumiendo que la probabilidad de mutación es lo suficientemente pequeña como para que esperemos solo una única mutación durante toda la fase de replicación, y que, para simplificar, realmente obtenemos solo una única mutación, entonces con probabilidad hay un solo sobreviviente, con probabilidad hay 2 sobrevivientes, etc. Es decir, la probabilidad escala como .
En particular, si la distribución del número de supervivientes resulta decaer más como una ley de potencia que como una exponencial, entonces podemos concluir con alta probabilidad estadística que el escenario darwiniano es cierto. Esta es una descripción general aproximada del experimento de Luria-Delbrück. (Sección 4.4 [1] )
En la década de 1940, las ideas de herencia y mutación eran generalmente aceptadas, aunque el papel del ADN como material hereditario aún no se había establecido. Se pensaba que las bacterias eran de alguna manera diferentes y podían desarrollar mutaciones genéticas hereditarias dependiendo de las circunstancias en las que se encontraban: en resumen, ¿la mutación en las bacterias era preadaptativa (preexistente) o postadaptativa (adaptación dirigida)? [2]
En su experimento, Luria y Delbrück inocularon una pequeña cantidad de bacterias ( Escherichia coli ) en tubos de cultivo separados . Después de un período de crecimiento, sembraron volúmenes iguales de estos cultivos separados en agar que contenía el fago T1 (virus). Si la resistencia al virus en las bacterias fuera causada por una activación inducida en las bacterias, es decir, si la resistencia no se debiera a componentes genéticos hereditarios, entonces cada placa debería contener aproximadamente el mismo número de colonias resistentes. Suponiendo una tasa constante de mutación, Luria planteó la hipótesis de que si las mutaciones ocurrieran después y en respuesta a la exposición al agente selectivo, el número de sobrevivientes se distribuiría de acuerdo con una distribución de Poisson con la media igual a la varianza . Esto no fue lo que Delbrück y Luria encontraron: en cambio, el número de colonias resistentes en cada placa variaba drásticamente: la varianza era considerablemente mayor que la media.
Luria y Delbrück propusieron que estos resultados podrían explicarse por la ocurrencia de una tasa constante de mutaciones aleatorias en cada generación de bacterias que crecen en los tubos de cultivo iniciales. Basándose en estos supuestos, Delbrück derivó una distribución de probabilidad (ahora llamada distribución de Luria-Delbrück [3] [4] ) que da una relación entre momentos consistente con los valores obtenidos experimentalmente. Por lo tanto, la conclusión fue que las mutaciones en las bacterias, como en otros organismos, son aleatorias en lugar de dirigidas. [5]
Los resultados de Luria y Delbrück fueron confirmados de una manera más gráfica, pero menos cuantitativa, por Newcombe. Newcombe incubó bacterias en una placa de Petri durante unas horas, luego las sembró en dos nuevas placas de Petri tratadas con fagos. La primera placa se dejó sin sembrar y la segunda se sembró nuevamente, es decir, las células bacterianas se movieron de un lado a otro para permitir que las células individuales de alguna colonia formaran sus propias colonias nuevas. Si las colonias contenían células bacterianas resistentes antes de entrar en contacto con el virus del fago, se esperaría que algunas de estas células formaran nuevas colonias resistentes en la placa se sembró nuevamente y, por lo tanto, encontrar allí un mayor número de bacterias supervivientes. Cuando se incubaron ambas placas para el crecimiento, en realidad había hasta 50 veces más colonias bacterianas en la placa se sembró nuevamente. Esto demostró que las mutaciones bacterianas a la resistencia al virus habían ocurrido aleatoriamente durante la primera incubación. Una vez más, las mutaciones ocurrieron antes de que se aplicara la selección. [6]
Más recientemente, los resultados de Luria y Delbrück fueron cuestionados por Cairns y otros, quienes estudiaron las mutaciones en el metabolismo del azúcar como una forma de estrés ambiental. [7] Algunos científicos sugieren que este resultado puede haber sido causado por la selección para la amplificación genética y/o una mayor tasa de mutación en células incapaces de dividirse. [8] Otros han defendido la investigación y proponen mecanismos que explican los fenómenos observados consistentes con la mutagénesis adaptativa . [9]
Parece que Haldane fue el primero en determinar esta distribución . [10] En 1991 se descubrió un manuscrito inédito en el University College de Londres que describía esta distribución. La derivación es diferente, pero los resultados son difíciles de calcular sin el uso de una computadora.
Se utiliza una pequeña cantidad de células para inocular cultivos paralelos en un medio no selectivo. [11] Los cultivos se cultivan hasta la saturación para obtener densidades celulares iguales. Las células se siembran en medios selectivos para obtener el número de mutantes ( r ) . Las diluciones se siembran en un medio rico para calcular el número total de células viables ( Nt ). El número de mutantes que aparecen en el cultivo saturado es una medida tanto de la tasa de mutación como de cuándo surgen los mutantes durante el crecimiento del cultivo: los mutantes que aparecen temprano en el crecimiento del cultivo propagarán muchos más mutantes que los que surgen más tarde durante el crecimiento. Estos factores hacen que la frecuencia ( r / Nt ) varíe mucho, incluso si el número de eventos mutacionales ( m ) es el mismo. La frecuencia no es una medida suficientemente precisa de la mutación y la tasa de mutación ( m / Nt ) siempre debe calcularse.
La estimación de la tasa de mutación (μ) es compleja. Luria y Delbruck estimaron este parámetro a partir de la media de la distribución, pero posteriormente se demostró que este estimador estaba sesgado.
El método Lea-Coulson de la mediana se introdujo en 1949. [12] Este método se basa en la ecuación
Este método se ha mejorado desde entonces, pero estos métodos más precisos son complejos. El estimador de máxima verosimilitud de Ma-Sandri-Sarkar es actualmente el estimador más conocido . [14] Se han descrito varios métodos y estimaciones adicionales a partir de datos experimentales. [15]
Existen dos aplicaciones web disponibles de forma gratuita para el cálculo de la tasa de mutación: Falcor [11] y bz-rates. Bz-rates implementa una versión generalizada del estimador de máxima verosimilitud de Ma-Sandri-Sarkar que puede tener en cuenta la tasa de crecimiento diferencial relativa entre células mutantes y de tipo salvaje, así como un estimador de función generadora que puede estimar tanto la tasa de mutación como la tasa de crecimiento diferencial. En este artículo de Jones et al . [16] se muestra un ejemplo práctico.
En todos estos modelos se supuso que la tasa de mutación ( μ ) y la tasa de crecimiento ( β ) eran constantes. El modelo se puede generalizar fácilmente para relajar estas y otras restricciones. [17] Es probable que estas tasas difieran en entornos no experimentales. Los modelos también requieren que N t μ >> 1 donde N t es el número total de organismos. Es probable que esta suposición se cumpla en la mayoría de los entornos realistas o experimentales.
Luria y Delbrück [5] estimaron la tasa de mutación (mutaciones por bacteria por unidad de tiempo) a partir de la ecuación
donde β es la tasa de crecimiento celular, n 0 es el número inicial de bacterias en cada cultivo, t es el tiempo y
donde N s es el número de cultivos sin bacterias resistentes y N es el número total de cultivos.
El modelo de Lea y Coulson [12] se diferenciaba del original en que consideraban una colección de procesos de Yule independientes (un proceso de Poisson filtrado ). Las comparaciones numéricas de estos dos modelos con valores realistas de los parámetros han demostrado que difieren sólo ligeramente. [18] La función generadora para este modelo fue encontrada por Bartlett en 1978 [19] y es
donde μ es la tasa de mutación (que se supone constante), φ = 1 − e − βt con β como la tasa de crecimiento celular (que también se supone constante) y t como el tiempo.
La determinación de μ a partir de esta ecuación ha resultado difícil, pero se descubrió una solución en 2005 [ cita requerida ] . La diferenciación de la función generadora con respecto a μ permite la aplicación del método de Newton-Raphson que, junto con el uso de una función de puntuación , permite obtener intervalos de confianza para μ .
El mecanismo de resistencia al fago T1 parece deberse a mutaciones en el gen fhu A, una proteína de membrana que actúa como receptor de T1. [20] El producto del gen ton B también es necesario para la infección por T1. La proteína FhuA participa activamente en el transporte de ferricromo , albomicina y rifamicina . [21] También confiere sensibilidad a la microcina J25 y a la colicina M y actúa como receptor de los fagos T5 y phi80, así como de T1.
La proteína FhuA tiene un dominio de barril beta (residuos 161 a 714) que está cerrado por un dominio de corcho globular (residuos 1 a 160). [22] Dentro del dominio de corcho se encuentra la región de unión de TonB (residuos 7 a 11). Los grandes dominios de barril beta monoméricos que abarcan la membrana tienen 22 cadenas beta de longitud variable, varias de las cuales se extienden significativamente más allá del núcleo hidrofóbico de la membrana hacia el espacio extracelular. Hay 11 bucles extracelulares numerados de L1 a L11. El bucle L4 es donde se une el fago T1.
![{\displaystyle \mu ={\frac {\beta \ln(\rho )}{n_{0}[1-\exp(\beta t)]}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/d63c6853332d87b431b4314bc6e62793c4f79d85)
