La extracción con tiocianato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo (abreviada AGPC ) es una técnica de extracción líquido-líquido en bioquímica y biología molecular . Se utiliza ampliamente para aislar ARN (así como ADN y proteínas en algunos casos). Este método puede llevar más tiempo que un sistema basado en columnas como la purificación basada en sílice, pero tiene mayor pureza y la ventaja de una alta recuperación de ARN. [1] Además, una columna de ARN normalmente no es adecuada para la purificación de especies de ARN cortas (<200 nucleótidos ), como ARNi , miARN y ARNt .
Fue ideado originalmente por Piotr Chomczynski y Nicoletta Sacchi , quienes publicaron su protocolo en 1987. [2] [3] El reactivo es vendido por Sigma-Aldrich con el nombre TRI Reagent; por Invitrogen bajo el nombre TRIzol ; por Bioline como Trisure; y por Tel-Test como STAT-60.
Este método se basa en la separación de fases por centrifugación de una mezcla de la muestra acuosa y una solución que contiene fenol y cloroformo saturados de agua , lo que da como resultado una fase acuosa superior y una fase orgánica inferior (principalmente fenol). El tiocianato de guanidinio , un agente caotrópico , se agrega a la fase orgánica para ayudar en la desnaturalización de las proteínas (como las que se unen fuertemente a los ácidos nucleicos o las que degradan el ARN). Los ácidos nucleicos (ARN y/o ADN) se reparten en la fase acuosa, mientras que las proteínas se reparten en la fase orgánica. El pH de la mezcla determina qué ácidos nucleicos se purifican. [4] En condiciones ácidas (pH 4-6), el ADN se reparte en la fase orgánica mientras que el ARN permanece en la fase acuosa. En condiciones neutras (pH 7-8), tanto el ADN como el ARN se reparten en la fase acuosa. En un último paso, los ácidos nucleicos se recuperan de la fase acuosa por precipitación con 2-propanol . Luego, el 2-propanol se lava con etanol y el pellet se seca brevemente al aire y se disuelve en tampón TE o agua libre de ARNasa.
El tiocianato de guanidinio desnaturaliza las proteínas, incluidas las ARNasas, y separa el ARNr de las proteínas ribosómicas, mientras que el fenol , el isopropanol y el agua son disolventes con poca solubilidad. En presencia de cloroformo o BCP (bromocloropropano), estos disolventes se separan completamente en dos fases que se reconocen por su color: una fase acuosa superior transparente (que contiene los ácidos nucleicos) y una fase inferior (que contiene las proteínas disueltas en fenol y los lípidos disueltos en cloroformo). También se pueden utilizar otros productos químicos desnaturalizantes como el 2-mercaptoetanol y la sarcosina . La principal desventaja es que tanto el fenol como el cloroformo son materiales peligrosos e inconvenientes, y la extracción suele ser laboriosa, por lo que en los últimos años muchas empresas ofrecen formas alternativas de aislar el ARN.