Un vector de expresión , también conocido como constructo de expresión , es generalmente un plásmido o virus diseñado para la expresión génica en células. El vector se utiliza para introducir un gen específico en una célula diana y puede controlar el mecanismo de síntesis de proteínas de la célula para producir la proteína codificada por el gen. Los vectores de expresión son las herramientas básicas en biotecnología para la producción de proteínas .
El vector está diseñado para contener secuencias reguladoras que actúan como regiones potenciadoras y promotoras y conducen a una transcripción eficiente del gen transportado en el vector de expresión. [1] El objetivo de un vector de expresión bien diseñado es la producción eficiente de proteínas, y esto se puede lograr mediante la producción de una cantidad significativa de ARN mensajero estable , que luego se puede traducir en proteína. La expresión de una proteína puede controlarse estrictamente, y la proteína solo se produce en cantidad significativa cuando es necesario mediante el uso de un inductor , sin embargo, en algunos sistemas la proteína puede expresarse de forma constitutiva. Escherichia coli se utiliza comúnmente como huésped para la producción de proteínas , pero también se pueden utilizar otros tipos de células. Un ejemplo del uso del vector de expresión es la producción de insulina , que se utiliza para tratamientos médicos de la diabetes .
Un vector de expresión tiene características que cualquier vector puede tener, como un origen de replicación , un marcador seleccionable y un sitio adecuado para la inserción de un gen como el sitio de clonación múltiple . El gen clonado puede ser transferido desde un vector de clonación especializado a un vector de expresión, aunque es posible clonar directamente en un vector de expresión. El proceso de clonación se realiza normalmente en Escherichia coli . Los vectores utilizados para la producción de proteínas en organismos distintos de E. coli pueden tener, además de un origen de replicación adecuado para su propagación en E. coli , elementos que les permitan mantenerse en otro organismo, y estos vectores se denominan vectores lanzadera .
Un vector de expresión debe tener elementos necesarios para la expresión génica. Estos pueden incluir un promotor , la secuencia de iniciación de la traducción correcta, como un sitio de unión ribosomal y un codón de inicio , un codón de terminación y una secuencia de terminación de la transcripción . [2] Existen diferencias en la maquinaria para la síntesis de proteínas entre procariotas y eucariotas, por lo tanto, los vectores de expresión deben tener los elementos para la expresión que sean apropiados para el huésped elegido. Por ejemplo, los vectores de expresión procariotas tendrían una secuencia Shine-Dalgarno en su sitio de inicio de la traducción para la unión de los ribosomas, mientras que los vectores de expresión eucariotas contendrían la secuencia de consenso de Kozak .
El promotor inicia la transcripción y, por lo tanto, es el punto de control para la expresión del gen clonado. Los promotores utilizados en el vector de expresión normalmente son inducibles , lo que significa que la síntesis de proteínas solo se inicia cuando es necesario mediante la introducción de un inductor como IPTG . Sin embargo, la expresión génica también puede ser constitutiva (es decir, la proteína se expresa constantemente) en algunos vectores de expresión. Puede producirse un bajo nivel de síntesis constitutiva de proteínas incluso en vectores de expresión con promotores estrictamente controlados.
Después de la expresión del producto génico, puede ser necesario purificar la proteína expresada; sin embargo, separar la proteína de interés de la gran mayoría de las proteínas de la célula huésped puede ser un proceso prolongado. Para facilitar este proceso de purificación, se puede añadir una etiqueta de purificación al gen clonado. Esta etiqueta podría ser una etiqueta de histidina (His) , otros péptidos marcadores o socios de fusión como la glutatión S-transferasa o la proteína de unión a maltosa . [3] Algunos de estos socios de fusión también pueden ayudar a aumentar la solubilidad de algunas proteínas expresadas. Otras proteínas de fusión, como la proteína fluorescente verde, pueden actuar como un gen reportero para la identificación de genes clonados con éxito, o pueden usarse para estudiar la expresión de proteínas en imágenes celulares . [4] [5]
El vector de expresión se transforma o transfecta en la célula huésped para la síntesis de proteínas. Algunos vectores de expresión pueden tener elementos para la transformación o la inserción de ADN en el cromosoma huésped, por ejemplo, los genes vir para la transformación de plantas y los sitios de integrasa para la integración cromosómica.
Algunos vectores pueden incluir una secuencia de orientación que puede dirigir la proteína expresada a una ubicación específica, como el espacio periplásmico de las bacterias.
Se pueden utilizar diferentes organismos para expresar la proteína diana de un gen y, por lo tanto, el vector de expresión utilizado tendrá elementos específicos para su uso en el organismo en particular. El organismo más comúnmente utilizado para la producción de proteínas es la bacteria Escherichia coli . Sin embargo, no todas las proteínas pueden expresarse con éxito en E. coli o expresarse con la forma correcta de modificaciones postraduccionales como las glicosilaciones, por lo que pueden utilizarse otros sistemas.
El hospedador de expresión de elección para la expresión de muchas proteínas es Escherichia coli , ya que la producción de proteínas heterólogas en E. coli es relativamente sencilla y cómoda, además de rápida y barata. También hay disponible una gran cantidad de plásmidos de expresión de E. coli para una amplia variedad de necesidades. Otras bacterias utilizadas para la producción de proteínas incluyen Bacillus subtilis .
La mayoría de las proteínas heterólogas se expresan en el citoplasma de E. coli . Sin embargo, no todas las proteínas formadas pueden ser solubles en el citoplasma, y las proteínas plegadas incorrectamente formadas en el citoplasma pueden formar agregados insolubles llamados cuerpos de inclusión . Estas proteínas insolubles requerirán un replegamiento, que puede ser un proceso complicado y no necesariamente producir un alto rendimiento. [6] Las proteínas que tienen enlaces disulfuro a menudo no pueden plegarse correctamente debido al entorno reductor en el citoplasma que impide la formación de dicho enlace, y una posible solución es dirigir la proteína al espacio periplásmico mediante el uso de una secuencia señal N-terminal . Otra posibilidad es manipular el entorno redox del citoplasma. [7] También se están desarrollando otros sistemas más sofisticados; dichos sistemas pueden permitir la expresión de proteínas que antes se creían imposibles en E. coli , como las proteínas glicosiladas . [8] [9] [10]
Los promotores utilizados para estos vectores se basan normalmente en el promotor del operón lac o el promotor T7 , [11] y normalmente están regulados por el operador lac . Estos promotores también pueden ser híbridos de diferentes promotores, por ejemplo, el promotor Tac es un híbrido de los promotores trp y lac . [12] Nótese que los promotores lac o derivados de lac más utilizados se basan en el mutante lac UV5 que es insensible a la represión por catabolitos . Este mutante permite la expresión de proteína bajo el control del promotor lac cuando el medio de crecimiento contiene glucosa ya que la glucosa inhibiría la expresión génica si se utiliza el promotor lac de tipo salvaje. [13] No obstante, la presencia de glucosa todavía puede utilizarse para reducir la expresión de fondo a través de la inhibición residual en algunos sistemas. [14]
Ejemplos de vectores de expresión de E. coli son la serie de vectores pGEX donde se utiliza la glutatión S-transferasa como socio de fusión y la expresión genética está bajo el control del promotor tac, [15] [16] [17] y la serie de vectores pET que utiliza un promotor T7 . [18]
Es posible expresar simultáneamente dos o más proteínas diferentes en E. coli utilizando plásmidos diferentes. Sin embargo, cuando se utilizan 2 o más plásmidos, cada plásmido debe utilizar una selección de antibiótico diferente, así como un origen de replicación diferente, de lo contrario, uno de los plásmidos puede no mantenerse estable. Muchos plásmidos de uso común se basan en el replicón ColE1 y, por lo tanto, son incompatibles entre sí; para que un plásmido basado en ColE1 coexista con otro en la misma célula, el otro tendría que ser de un replicón diferente, por ejemplo, un plásmido basado en el replicón p15A, como la serie de plásmidos pACYC. [19] Otro enfoque sería utilizar un solo vector de dos cistrones o diseñar las secuencias codificantes en tándem como una construcción bi- o poli-cistrónica. [20] [21]
Una levadura comúnmente utilizada para la producción de proteínas es Pichia pastoris . [22] Ejemplos de vectores de expresión de levadura en Pichia son la serie de vectores pPIC, y estos vectores utilizan el promotor AOX1 que es inducible con metanol . [23] Los plásmidos pueden contener elementos para la inserción de ADN extraño en el genoma de la levadura y una secuencia señal para la secreción de la proteína expresada. Las proteínas con enlaces disulfuro y glicosilación se pueden producir de manera eficiente en la levadura. Otra levadura utilizada para la producción de proteínas es Kluyveromyces lactis y el gen se expresa, impulsado por una variante del fuerte promotor de lactasa LAC4. [24]
Saccharomyces cerevisiae se utiliza especialmente para estudios de expresión genética en levaduras, por ejemplo, en sistemas de dos híbridos de levaduras para el estudio de la interacción proteína-proteína. [25] Los vectores utilizados en sistemas de dos híbridos de levaduras contienen socios de fusión para dos genes clonados que permiten la transcripción de un gen reportero cuando hay interacción entre las dos proteínas expresadas a partir de los genes clonados.
El baculovirus , un virus con forma de bastón que infecta células de insectos, se utiliza como vector de expresión en este sistema. [26] Las líneas celulares de insectos derivadas de lepidópteros (polillas y mariposas), como Spodoptera frugiperda , se utilizan como hospedadores. Una línea celular derivada de la oruga de la col es de particular interés, ya que se ha desarrollado para crecer rápido y sin el costoso suero normalmente necesario para estimular el crecimiento celular. [27] [28] El vector lanzadera se llama bacmid, y la expresión génica está bajo el control de un fuerte promotor pPolh. [29] El baculovirus también se ha utilizado con líneas celulares de mamíferos en el sistema BacMam . [30]
El baculovirus se utiliza normalmente para la producción de glicoproteínas , aunque las glicosilaciones pueden ser diferentes a las que se encuentran en los vertebrados. En general, es más seguro de usar que el virus de los mamíferos, ya que tiene un rango de hospedadores limitado y no infecta a los vertebrados sin modificaciones.
Muchos vectores de expresión de plantas se basan en el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens . [31] En estos vectores de expresión, el ADN que se insertará en la planta se clona en el ADN-T , un tramo de ADN flanqueado por una secuencia de repetición directa de 25 pb en cada extremo, y que puede integrarse en el genoma de la planta. El ADN-T también contiene el marcador seleccionable. Agrobacterium proporciona un mecanismo para la transformación , la integración en el genoma de la planta y los promotores de sus genes vir también pueden usarse para los genes clonados. Sin embargo, las preocupaciones sobre la transferencia de material genético bacteriano o viral a la planta han llevado al desarrollo de vectores llamados vectores intragénicos mediante los cuales se utilizan equivalentes funcionales del genoma de la planta para que no haya transferencia de material genético de una especie extraña a la planta. [32]
Los virus de plantas pueden utilizarse como vectores, ya que el método de Agrobacterium no funciona para todas las plantas. Algunos ejemplos de virus de plantas utilizados son el virus del mosaico del tabaco (TMV), el virus X de la patata y el virus del mosaico del caupí . [33] La proteína puede expresarse como una fusión con la proteína de la cubierta del virus y se muestra en la superficie de partículas virales ensambladas, o como una proteína no fusionada que se acumula dentro de la planta. La expresión en plantas utilizando vectores vegetales suele ser constitutiva, [34] y un promotor constitutivo de uso común en vectores de expresión vegetal es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). [35] [36]
Los vectores de expresión de mamíferos ofrecen ventajas considerables para la expresión de proteínas de mamíferos en comparación con los sistemas de expresión bacterianos: plegamiento adecuado, modificaciones postraduccionales y actividad enzimática relevante. También pueden ser más deseables que otros sistemas eucariotas no mamíferos en los que las proteínas expresadas pueden no contener las glicosilaciones correctas. Es de particular utilidad para producir proteínas asociadas a la membrana que requieren chaperonas para un plegamiento y estabilidad adecuados, además de contener numerosas modificaciones postraduccionales. Sin embargo, la desventaja es el bajo rendimiento del producto en comparación con los vectores procariotas, así como la naturaleza costosa de las técnicas involucradas. Su tecnología complicada y la posible contaminación con virus animales de la expresión de células de mamíferos también han limitado su uso en la producción industrial a gran escala. [37]
Las líneas celulares de mamíferos cultivadas, como el ovario de hámster chino (CHO) , COS , incluidas las líneas celulares humanas como HEK y HeLa, se pueden utilizar para producir proteínas. Los vectores se transfectan en las células y el ADN se puede integrar en el genoma mediante recombinación homóloga en el caso de una transfección estable, o las células se pueden transfectar transitoriamente. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen los vectores adenovirales , [38] las series pSV y pCMV de vectores plasmídicos, vectores vaccinia y retrovirales , [39] así como baculovirus. [30] Los promotores de citomegalovirus (CMV) y SV40 se utilizan comúnmente en vectores de expresión de mamíferos para impulsar la expresión génica. También se conocen promotores no virales, como el promotor del factor de elongación (EF)-1. [40]
En este método in vitro de producción de proteínas se utilizan lisados de células de E. coli que contienen los componentes celulares necesarios para la transcripción y la traducción. La ventaja de este sistema es que la proteína se puede producir mucho más rápido que las producidas in vivo, ya que no requiere tiempo para cultivar las células, pero también es más costoso. Los vectores utilizados para la expresión de E. coli se pueden utilizar en este sistema, aunque también hay vectores diseñados específicamente para este sistema. Los extractos de células eucariotas también se pueden utilizar en otros sistemas libres de células, por ejemplo, los sistemas de expresión libres de células de germen de trigo . [41] También se han producido sistemas libres de células de mamíferos. [42]
El vector de expresión en un huésped de expresión es actualmente el método habitual que se utiliza en los laboratorios para producir proteínas destinadas a la investigación. La mayoría de las proteínas se producen en E. coli , pero para las proteínas glicosiladas y las que tienen enlaces disulfuro se pueden utilizar sistemas de levaduras, baculovirus y mamíferos.
La mayoría de los productos farmacéuticos proteicos se producen ahora a través de tecnología de ADN recombinante utilizando vectores de expresión. Estos productos farmacéuticos peptídicos y proteicos pueden ser hormonas, vacunas, antibióticos, anticuerpos y enzimas. [43] La primera proteína recombinante humana utilizada para el tratamiento de enfermedades, la insulina, se introdujo en 1982. [43] La biotecnología permite que estos productos farmacéuticos peptídicos y proteicos, algunos de los cuales anteriormente eran raros o difíciles de obtener, se produzcan en grandes cantidades. También reduce los riesgos de contaminantes como virus hospedadores, toxinas y priones . Los ejemplos del pasado incluyen contaminación priónica en la hormona de crecimiento extraída de glándulas pituitarias recolectadas de cadáveres humanos, que causó la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en pacientes que recibían tratamiento para enanismo , [44] y contaminantes virales en el factor de coagulación VIII aislado de sangre humana que resultó en la transmisión de enfermedades virales como la hepatitis y el SIDA . [45] [46] Tal riesgo se reduce o elimina por completo cuando las proteínas se producen en células hospedadoras no humanas.
En los últimos años, los vectores de expresión se han utilizado para introducir genes específicos en plantas y animales para producir organismos transgénicos , por ejemplo, en la agricultura se utiliza para producir plantas transgénicas . Los vectores de expresión se han utilizado para introducir un precursor de la vitamina A , el betacaroteno , en las plantas de arroz. Este producto se llama arroz dorado . Este proceso también se ha utilizado para introducir un gen en las plantas que produce un insecticida , llamado toxina de Bacillus thuringiensis o toxina Bt , que reduce la necesidad de que los agricultores apliquen insecticidas, ya que es producida por el organismo modificado. Además, los vectores de expresión se utilizan para extender la maduración de los tomates alterando la planta para que produzca menos del químico que hace que los tomates se pudran. [47] Ha habido controversias sobre el uso de vectores de expresión para modificar los cultivos debido al hecho de que podría haber riesgos desconocidos para la salud, posibilidades de que las empresas patenten ciertos cultivos alimentarios modificados genéticamente y preocupaciones éticas. Sin embargo, esta técnica todavía se está utilizando y se está investigando intensamente.
También se han producido animales transgénicos para estudiar los procesos bioquímicos animales y las enfermedades humanas, o se han utilizado para producir fármacos y otras proteínas. También se los puede modificar para que tengan rasgos ventajosos o útiles. La proteína fluorescente verde se utiliza a veces como etiqueta, lo que da como resultado animales que pueden emitir fluorescencia, y esto se ha explotado comercialmente para producir el GloFish fluorescente .
La terapia génica es un tratamiento prometedor para una serie de enfermedades en las que se inserta en el genoma un gen "normal" transportado por el vector para sustituir un gen "anormal" o complementar la expresión de un gen concreto. Generalmente se utilizan vectores virales, pero se están desarrollando otros métodos de administración no virales. El tratamiento sigue siendo una opción arriesgada debido al vector viral utilizado, que puede causar efectos nocivos, por ejemplo, dar lugar a una mutación insercional que puede provocar cáncer. [48] [49] Sin embargo, se han obtenido resultados prometedores. [50] [51]
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