La electroforesis de flujo libre ( FFE ), también conocida como electroforesis sin portador , es una técnica de separación electroforética de alto voltaje y sin matriz . La FFE es una técnica análoga a la electroforesis capilar , con una resolución comparable, que se puede utilizar para cuestiones científicas, donde se necesitan cantidades de muestras semipreparativas y preparativas. Se utiliza para separar cuantitativamente las muestras según las diferencias de carga o punto isoeléctrico formando un gradiente de pH . Debido a la versatilidad de la técnica, existe una amplia gama de protocolos para la separación de muestras como iones de metales raros , isoformas de proteínas , complejos multiproteicos , péptidos , orgánulos , células , origami de ADN , suero sanguíneo y nanopartículas . La ventaja de la FFE es la separación rápida y suave de las muestras disueltas en un disolvente líquido sin necesidad de una matriz, como la poliacrilamida en la electroforesis en gel . Esto asegura una tasa de recuperación muy alta ya que los analitos no se adhieren a ninguna estructura de portador o matriz. Debido a su naturaleza continua y a su alto rendimiento volumétrico, esta técnica permite una separación rápida de cantidades preparativas de muestras con una resolución muy alta. Además, las separaciones se pueden realizar en condiciones nativas o desnaturalizantes. [1]
La FFE fue desarrollada en la década de 1960 por Kurt Hannig en el Instituto Max-Planck en Alemania. [2] Hasta la década de 1980, era una tecnología estandarizada para la separación de células y orgánulos , y la FFE incluso se probó en el espacio para minimizar la sedimentación en gravedad cero . [3] A medida que la citometría de flujo se convirtió en el método estándar para la clasificación celular, los desarrollos de FFE se centraron en la separación de proteínas y partículas cargadas. Algunos grupos también están trabajando en versiones miniaturizadas de sistemas FFE o micro FFE. [4]
La cámara de separación consta de una placa posterior y una placa frontal. La placa posterior suele estar formada por un bloque de aluminio refrigerado, cubierto con un espejo de vidrio recubierto de plástico. La placa frontal está hecha actualmente de PMMA , en épocas anteriores se ha utilizado vidrio. La distancia entre la placa frontal y la posterior se puede ajustar mediante espaciadores y suele estar entre 0,1 y 0,5 mm. La placa frontal también contiene las entradas para los tampones de separación y la muestra, las salidas para los tubos de fraccionamiento y los cables de platino como electrodos. Al aplicar diferentes tampones sobre las múltiples entradas de tampón, el operador puede cambiar el pH, las concentraciones de sal o la composición y, por lo tanto, las condiciones de separación sobre el ancho de la cámara. Los tampones de separación y la muestra se aplican mediante bombas peristálticas , para garantizar un flujo laminar . Se aplica un campo eléctrico de alto voltaje perpendicular al flujo laminar. Los analitos en el flujo laminar se pueden separar por densidad de carga y punto isoeléctrico . Debido a su naturaleza altamente versátil, esta técnica puede hacer uso de diferentes modos de electroforesis, como por ejemplo isotacoforesis, isoelectroenfoque o electroforesis de zona (de intervalo). [ cita requerida ]
Al final de la celda de separación, la muestra separada se divide en los tubos de fraccionamiento y se recoge en placas de microtitulación. [5]
Posteriormente, las muestras se pueden caracterizar mediante todas las técnicas principales como HPLC , LC-MS , espectrometría de masas ( ESI / MALDI , dependiendo del protocolo utilizado) o electroforesis (IEF/ SDS PAGE , 2D-PAGE ). [ cita requerida ]
Las aplicaciones estándar incluyen la separación de alta resolución de complejos proteicos, proteínas de membrana, isoformas de proteínas y anticuerpos, células, compartimentos subcelulares (como orgánulos, ribosomas) y liposomas. [6] Al hacer uso de gradientes de pH muy planos, generados por anfolitos , es posible separar isoformas de proteínas, que varían en menos de 0,02 unidades de pH, con un rendimiento de alrededor de 3 mg/h. [7] También es posible agregar aditivos a los tampones para aumentar la resolución o desnaturalizar las muestras. Típicamente se toleran concentraciones de urea de hasta 8 M, 0,1–1% de detergentes como: CHAPS, CHAPSO, Digitonina, Dodecil-ß-D-maltósido, Octil-ß-D-glucósido, Triton-X-114 (IEF) y DTT hasta 50 mM. [ cita requerida ]
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