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La tinción de Romanowsky es una técnica de tinción prototípica que fue la precursora de varias tinciones distintas pero similares ampliamente utilizadas en hematología (el estudio de la sangre) y citopatología (el estudio de las células enfermas). Las tinciones de tipo Romanowsky se utilizan para diferenciar células para su examen microscópico en muestras patológicas , especialmente frotis de sangre y médula ósea , [1] y para detectar parásitos como la malaria dentro de la sangre. [2] [3] [4] [5]
La técnica de tinción recibe su nombre en honor al médico ruso Dmitri Leonidovich Romanowsky (1861-1921), quien fue uno de los primeros en reconocer su potencial para usarse como mancha de sangre. [6]
Las tinciones relacionadas con las tinciones de tipo Romanowsky o derivadas de ellas incluyen las tinciones de Giemsa , Jenner , Wright , Field , May–Grünwald , Pappenheim y Leishman . Se diferencian en los protocolos y aditivos y sus nombres suelen confundirse entre sí en la práctica.
El valor de la tinción de Romanowsky reside en su capacidad de producir una amplia gama de tonos, lo que permite diferenciar fácilmente los componentes celulares. Este fenómeno se conoce como efecto Romanowsky o, de forma más general, como metacromasia . [7]
La parte eosina del colorante es responsable del tono rosa-naranja de los eritrocitos y gránulos dentro de los citoplasmas de los leucocitos eosinofílicos .
En 1891, Romanowsky [8] [9] [10] desarrolló una tinción que utilizaba una mezcla de eosina (normalmente eosina Y ) y soluciones envejecidas de azul de metileno que formaban tonalidades no atribuibles a los componentes de la tinción por sí solos: tonos distintivos de púrpura en la cromatina del núcleo celular y dentro de los gránulos en el citoplasma de algunos leucocitos . Esto se conoció como el efecto Romanowsky. [11] [12] [6] [13] [4] La eosina y el azul de metileno puro solos (o en combinación) no producen el efecto Romanowsky, [13] [4] y ahora se considera que las tinciones activas que producen el efecto son el azul B y la eosina. [14] [3] [13]
Las tinciones de tipo Romanowsky se pueden realizar a partir de una combinación de colorantes puros o de azul de metileno que ha sido sometido a desmetilación oxidativa , lo que da como resultado la descomposición del azul de metileno en múltiples otras tinciones, algunas de las cuales son necesarias para producir el efecto Romanowsky. [15] [4] El azul de metileno que ha sufrido este proceso oxidativo se conoce como "azul de metileno policromado". [15] [4] El azul de metileno policromado puede contener hasta 11 colorantes, incluidos azul de metileno , azur A , azur B, azur C, tionina , violeta de metileno Bernthesen, metil tionolina y tionolina. [4] La composición exacta del azul de metileno policromado depende del método utilizado, e incluso los lotes de la tinción del mismo fabricante pueden variar en composición. [15]
El método común de oxidación rápida utiliza el aumento del pH de la solución con carbonato de potasio y su ebullición, lo que introduce oxígeno atmosférico . [16] También se han empleado otros métodos, como la oxidación en medio ácido con el anión dicromato .
Aunque se ha demostrado que el azul B y la eosina son los componentes necesarios para producir el efecto Romanowsky, [14] [3] [13] estas tinciones en sus formas puras no siempre se han utilizado en la formulación de las soluciones de tinción. [4] Las fuentes originales de azul B (uno de los productos de oxidación del azul de metileno) provenían de soluciones de azul de metileno policromadas, que se trataban con agentes oxidantes o se dejaban envejecer de forma natural en el caso de Romanowsky. [3] [13] Ernst Malachowsky en 1891 fue el primero en policromar deliberadamente el azul de metileno para su uso en una tinción de tipo Romanowsky. [15] [17]
La tinción de Wright se puede utilizar sola o en combinación con la tinción de Giemsa, que se conoce como tinción de Wright-Giemsa. [1] La tinción de Wright recibe su nombre de James Homer Wright, quien en 1902 [18] publicó un método que utiliza calor para producir azul de metileno policromado, que se combina con eosina Y. [19] [20] [21] [1] El azul de metileno policromado se combina con eosina y se deja precipitar, formando un eosinato que se redisuelve en metanol . [4] La adición de Giemsa a la tinción de Wright aumenta el brillo del color "púrpura rojizo" de los gránulos citoplasmáticos. [1] [21] Las tinciones de Wright y Wright-Giemsa son dos de las tinciones de tipo Romanowsky de uso común en los Estados Unidos y se utilizan principalmente para la tinción de frotis de sangre y médula ósea. [21] [1]
La tinción de Jenner se utiliza en microscopía para teñir frotis de sangre . La tinción es de color azul oscuro y da como resultado un núcleo claramente teñido y muy visible.
La tinción de Giemsa se compone de "Azure II" y eosina Y con metanol y glicerol como disolvente. [15] Se cree que "Azure II" es una mezcla de azure B (al que Giemsa llamó "azure I") y azul de metileno, aunque la composición exacta de "azure I" se considera un secreto comercial. [4] [15] Se han publicado formulaciones comparables que utilizan colorantes conocidos y están disponibles comercialmente. La tinción de Giemsa se considera la tinción estándar para la detección e identificación del parásito de la malaria. [5]
El método May-Grünwald-Giemsa se utiliza para la tinción de portaobjetos obtenidos por aspiración con aguja fina en un laboratorio de histopatología para el diagnóstico de células tumorales.
Este método es una combinación de la tinción de May-Grünwald y Giemsa.
En 1901, William Leishman [22] desarrolló una tinción similar a la de Louis Jenner pero con el reemplazo del azul de metileno puro por azul de metileno policromado. [19] [15] [4] La tinción de Leishman se prepara a partir del eosinato de azul de metileno policromado y eosina Y usando metanol como solvente. [4]
La tinción de campo se utiliza para teñir frotis gruesos de sangre con el fin de descubrir parásitos de la malaria .
Las tinciones de tipo Romanowsky se utilizan ampliamente en el examen de sangre, en forma de frotis de sangre , y en el examen microscópico de biopsias de médula ósea y frotis aspirados. [1] [23] El examen tanto de la sangre como de la médula ósea puede ser importante en el diagnóstico de una variedad de enfermedades de la sangre. [1] [23] En los Estados Unidos, las variantes Wright y Wright-Giemsa de las tinciones de tipo Romanowsky se utilizan ampliamente, [1] mientras que en Europa se emplea comúnmente la tinción de Giemsa. [1]
De las tinciones de tipo Romanowsky, la tinción de Giemsa es especialmente importante en la detección e identificación de parásitos de la malaria en muestras de sangre . [5] [15] Las pruebas de detección de antígenos de la malaria son una alternativa a la tinción y el examen microscópico de frotis de sangre para la detección de la malaria. [5]
Las tinciones de tipo Romanowsky también se utilizan para la tinción de muestras citopatológicas como las producidas a partir de aspirados con aguja fina y líquido cefalorraquídeo de punciones lumbares . [24]
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Aunque existe debate sobre a quién se le atribuye el mérito de este método de tinción general, el uso popular lo ha atribuido a Dmitri Leonidovich Romanowsky . [14] [17] [19]
En la década de 1870, Paul Ehrlich utilizó una mezcla de colorantes ácidos y básicos, incluyendo fucsina ácida (colorante ácido) y azul de metileno (colorante básico) para examinar frotis de sangre. [25] [26] [27] [28] [17] En 1888, Cheslav Ivanovich Chenzinsky utilizó azul de metileno, pero sustituyó la fucsina ácida utilizada por Ehrlich con eosina. [14] [27] [28] La combinación de tinciones de Chenzinsky fue capaz de teñir el parásito de la malaria (un miembro del género Plasmodium ). [28] [19] Ni las tinciones de Ehrlich ni las de Chenzinsky produjeron el efecto Romanowsky ya que el azul de metileno que utilizaron no estaba policromado. [17]
En 1890, Dmitri Romanowsky publicó los resultados preliminares de su tinción de sangre (una combinación de azul de metileno envejecido y eosina), incluidos los resultados cuando se aplicó a sangre infectada con malaria. [6] Este uso de azul de metileno policromado diferenció la tinción de Romanowsky (y las formulaciones posteriores) de las de Ehrlich y Chenzinsky, que carecían del tono púrpura asociado con el efecto Romanowsky. [17] La publicación de Romanowsky de 1890 no incluía una descripción de cómo modificó su solución de azul de metileno, [6] [17] pero en su tesis doctoral de 1891 describió mejor el azul de metileno como se usa después de que comenzó a formarse moho en la superficie. [6] [17] Aparte del uso de una solución de azul de metileno envejecido, la tinción de Romanowsky se basó en la técnica de tinción de Chenzinsky. [17] El uso de Romanowsky de su método para estudiar el parásito de la malaria se ha atribuido al continuo interés en su método de tinción. [26]
Se le atribuye a Ernst Malachowsky la observación independiente de la misma combinación de tinciones que Dmitri Romanowsky en 1891, [6] [13] aunque también se le atribuye ser el primero en hacerlo. [17] [19] Malachowsky fue el primero en utilizar una solución de azul de metileno deliberadamente policromada, [15] lo que Malachowsky logró mediante la adición de bórax a la mezcla de tinción. [17] Se informa que Malachowsky demostró la tinción el 15 de junio de 1890 y que en el mismo año publicó un artículo "que describe su demostración pública". [19] Tanto el método de Romanowsky como el de Malachowsky pudieron teñir el núcleo y el citoplasma del parásito de la malaria , cuando hasta ese momento las tinciones utilizadas solo habían coloreado el citoplasma. [19]
En 1899, Louis Leopold Jenner desarrolló una versión más estable de la tinción de azul de metileno y eosina al recolectar el precipitado que se forma en mezclas a base de agua y redisolverlo en metanol . [28] [15] [4] Las tinciones de tipo Romanowsky preparadas a partir de los precipitados recolectados a veces se conocen como eosinatos . [4] Además de aumentar la estabilidad de la tinción, el uso de metanol en la tinción de Jenner tuvo el efecto de fijar las muestras de sangre, [4] aunque la versión de la tinción de Jenner no produce el efecto Romanowsky. [28] [19] [15]
Richard May y Ludwig Grünwald publicaron en 1892 una versión de la tinción (ahora conocida como tinción de May-Grünwald ) que es similar a la versión propuesta por Jenner en 1899, y tampoco produce el efecto Romanowsky. [28] [19] [15]
En 1901, tanto Karl Reuter como William Leishman [22] desarrollaron tinciones que combinaban el uso de alcohol como solvente de Louis Jenner y el uso de azul de metileno policromado de Malachowsky. [19] [15] [4] La tinción de Reuter se diferenciaba de la de Jenner en que usaba alcohol etílico en lugar de metanol, y la de Leishman se diferenciaba de la de Jenner en que usaba eosina B en lugar de eosina Y. [ 19] [4]
James Homer Wright publicó en 1902 [18] un método que utilizaba calor para policromar el azul de metileno, que combinó con eosina Y. Esta técnica se conoce como tinción de Wright . [19] [20]
El nombre de Gustav Giemsa también se ha asociado con la tinción, ya que se le atribuye la publicación de una formulación y un protocolo útiles en 1902. [13] [6] [26] Giemsa intentó utilizar combinaciones de tintes puros en lugar de soluciones de azul de metileno policromado que son muy variables en composición. [20] [19] [15] Giemsa vendió los derechos para producir su tinción, pero nunca publicó detalles completos sobre cómo la produjo, [19] aunque se cree que utilizó una combinación de azul B y azul de metileno. [15] Giemsa publicó una serie de modificaciones de sus tinciones entre 1902 y 1934. En 1904 [29] sugirió agregar glicerina a su tinción, junto con el metanol, para aumentar su estabilidad. [23] [19]
Los polvos de tinción de Giemsa producidos en Alemania se usaron ampliamente en los Estados Unidos hasta la interrupción del suministro durante la Primera Guerra Mundial , lo que provocó una mayor utilización del método de James Homer Wright para policromar el azul de metileno. [19] [1]