El cribado de alto contenido (HCS), también conocido como análisis de alto contenido (HCA) o celómica , es un método que se utiliza en la investigación biológica y el descubrimiento de fármacos para identificar sustancias como moléculas pequeñas , péptidos o ARNi que alteran el fenotipo de una celda de la manera deseada. [1] [2] Por lo tanto, el cribado de alto contenido es un tipo de cribado fenotípico realizado en células que implica el análisis de células enteras o componentes de células con lectura simultánea de varios parámetros. [3] La HCS está relacionada con la detección de alto rendimiento (HTS), en la que se prueban miles de compuestos en paralelo para determinar su actividad en uno o más ensayos biológicos, pero implica ensayos de fenotipos celulares más complejos como resultados. [4] Los cambios fenotípicos pueden incluir aumentos o disminuciones en la producción de productos celulares como proteínas y/o cambios en la morfología (apariencia visual) de la célula. Por lo tanto, la HCA normalmente implica microscopía y análisis de imágenes automatizados. [4] A diferencia del análisis de alto contenido, la detección de alto contenido implica un nivel de rendimiento, razón por la cual el término "detección" diferencia HCS de HCA, que puede tener un alto contenido pero un bajo rendimiento.
En el cribado de alto contenido, primero se incuban las células con la sustancia y, después de un período de tiempo, se analizan las estructuras y los componentes moleculares de las células. El análisis más común implica marcar proteínas con etiquetas fluorescentes y, finalmente, se miden los cambios en el fenotipo celular mediante análisis de imágenes automatizado . Mediante el uso de etiquetas fluorescentes con diferentes máximos de absorción y emisión, es posible medir varios componentes celulares diferentes en paralelo. Además, las imágenes pueden detectar cambios a nivel subcelular (p. ej., citoplasma frente a núcleo frente a otros orgánulos ). Por lo tanto, se puede recopilar una gran cantidad de puntos de datos por celda. Además del etiquetado fluorescente, se han utilizado varios ensayos sin etiquetas en la detección de alto contenido. [5]
La detección de alto contenido (HCS) en sistemas celulares utiliza células vivas como herramientas en la investigación biológica para dilucidar el funcionamiento de las células normales y enfermas. HCS también se utiliza para descubrir y optimizar nuevos fármacos candidatos. El cribado de alto contenido es una combinación de la biología celular moderna , con todas sus herramientas moleculares, con microscopía automatizada de alta resolución y manipulación robótica. Las células se exponen primero a sustancias químicas o reactivos de ARNi . Luego se detectan cambios en la morfología celular mediante análisis de imágenes . Los cambios en las cantidades de proteínas sintetizadas por las células se miden utilizando una variedad de técnicas, como las proteínas fluorescentes verdes fusionadas con proteínas endógenas o mediante anticuerpos fluorescentes .
La tecnología se puede utilizar para determinar si un fármaco potencial modifica la enfermedad. Por ejemplo, en los seres humanos los receptores acoplados a proteína G (GPCR) son una gran familia de alrededor de 880 proteínas de la superficie celular que transducen cambios extracelulares en el medio ambiente en una respuesta celular, como desencadenar un aumento de la presión arterial debido a la liberación de un hormona reguladora al torrente sanguíneo. La activación de estos GPCR puede implicar su entrada en las células y, cuando esto se puede visualizar, puede ser la base de un análisis sistemático de la función del receptor mediante genética química , detección sistemática de todo el genoma o manipulación fisiológica.
A nivel celular, la adquisición paralela de datos sobre diferentes propiedades celulares, por ejemplo, la actividad de las cascadas de transducción de señales y la integridad del citoesqueleto, es la principal ventaja de este método en comparación con el cribado de alto rendimiento, más rápido pero menos detallado . Si bien la HCS es más lenta, la gran cantidad de datos adquiridos permite una comprensión más profunda de los efectos de las drogas.
El cribado automatizado basado en imágenes permite la identificación de pequeños compuestos que alteran los fenotipos celulares y es de interés para el descubrimiento de nuevos productos farmacéuticos y nuevas herramientas biológicas celulares para modificar la función celular. La selección de moléculas en función de un fenotipo celular no requiere un conocimiento previo de las dianas bioquímicas que se ven afectadas por los compuestos. Sin embargo, la identificación del objetivo biológico facilitará significativamente la posterior optimización preclínica y el desarrollo clínico del compuesto. Dado el aumento en el uso de la detección fenotípica/visual como herramienta biológica celular, se requieren métodos que permitan la identificación sistemática de objetivos bioquímicos para que estas moléculas sean de uso amplio. [6] La identificación del objetivo se ha definido como el paso limitante de la tasa en la genética química/detección de alto contenido. [7]
La tecnología de detección de alto contenido se basa principalmente en microscopía digital automatizada y citometría de flujo , en combinación con sistemas informáticos para el análisis y almacenamiento de datos. La tecnología de “alto contenido” o biología visual tiene dos propósitos: primero, adquirir información resuelta espacial o temporalmente sobre un evento y, segundo, cuantificarla automáticamente. Los instrumentos de resolución espacial suelen ser microscopios automatizados y la resolución temporal aún requiere alguna forma de medición de fluorescencia en la mayoría de los casos. Esto significa que muchos instrumentos HCS son microscopios ( de fluorescencia ) que están conectados a algún tipo de paquete de análisis de imágenes. Estos se encargan de todos los pasos para tomar imágenes fluorescentes de células y proporcionan una evaluación rápida, automatizada e imparcial de los experimentos.
Los instrumentos HCS que se encuentran actualmente en el mercado se pueden separar según una serie de especificaciones que influyen significativamente en la versatilidad y el costo general de los instrumentos. Estos incluyen velocidad, una cámara de células vivas que incluye control de temperatura y CO 2 (algunos también tienen control de humedad para obtener imágenes de células vivas a más largo plazo), una pipeta o inyector incorporado para ensayos cinéticos rápidos y modos de imágenes adicionales como confocal y campo brillante. , contraste de fase y FRET. Una de las diferencias más incisivas es si los instrumentos son ópticos confocales o no. La microscopía confocal se resume en obtener imágenes/resolver un corte delgado a través de un objeto y rechazar la luz desenfocada que proviene del exterior de este corte. Las imágenes confocales permiten una relación señal-ruido de imagen más alta y una resolución más alta que la microscopía de epifluorescencia aplicada más comúnmente . Dependiendo del instrumento, la confocalidad se logra mediante escaneo láser, un solo disco giratorio con orificios o hendiduras, un disco giratorio doble o una hendidura virtual. Existen compensaciones de sensibilidad, resolución, velocidad, fototoxicidad, fotoblanqueo, complejidad del instrumento y precio entre estas diversas técnicas confocales.
Lo que comparten todos los instrumentos es la capacidad de tomar, almacenar e interpretar imágenes automáticamente e integrarlas en grandes plataformas robóticas de manipulación mediana.
Muchas pantallas se analizan utilizando el software de análisis de imágenes que acompaña al instrumento, lo que proporciona una solución llave en mano. Las alternativas de software de terceros se utilizan a menudo para pantallas particularmente desafiantes o cuando un laboratorio o instalación tiene múltiples instrumentos y desea estandarizarlos a una única plataforma de análisis. Sin embargo, algunos software de instrumentos proporcionan importación y exportación masiva de imágenes y datos para los usuarios que desean realizar dicha estandarización en una única plataforma de análisis sin el uso de software de terceros.
Esta tecnología permite realizar una (muy) gran cantidad de experimentos, lo que permite realizar un cribado exploratorio. Los sistemas basados en células se utilizan principalmente en genética química, donde se prueban sistemáticamente colecciones grandes y diversas de moléculas pequeñas para determinar su efecto en sistemas modelo celulares. Se pueden encontrar nuevos fármacos mediante análisis de decenas de miles de moléculas, y estos son prometedores para el futuro del desarrollo de fármacos. Más allá del descubrimiento de fármacos, la genética química tiene como objetivo funcionalizar el genoma mediante la identificación de pequeñas moléculas que actúan sobre la mayoría de los 21.000 productos genéticos de una célula. La tecnología de alto contenido será parte de este esfuerzo que podría proporcionar herramientas útiles para aprender dónde y cuándo actúan las proteínas eliminándolas químicamente. Esto sería más útil para genes en los que no se pueden producir ratones inactivados (a los que les faltan uno o varios genes) porque la proteína es necesaria para el desarrollo, el crecimiento o es letal cuando no está allí. La eliminación química podría abordar cómo y dónde funcionan estos genes. Además, la tecnología se utiliza en combinación con ARNi para identificar conjuntos de genes implicados en mecanismos específicos, por ejemplo, la división celular. Aquí, se pueden utilizar bibliotecas de ARNis, que cubren un conjunto completo de genes predichos dentro del genoma del organismo objetivo, para identificar subconjuntos relevantes, facilitando la anotación de genes para los cuales no se ha establecido de antemano una función clara. Los grandes conjuntos de datos producidos por la biología celular automatizada contienen datos cuantitativos resueltos espacialmente que pueden usarse para construir modelos a nivel de sistemas y simulaciones de cómo funcionan las células y los organismos. Los modelos de biología de sistemas de la función celular permitirían predecir por qué, dónde y cómo responde la célula a los cambios externos, el crecimiento y las enfermedades.
La tecnología de detección de alto contenido permite la evaluación de múltiples parámetros bioquímicos y morfológicos en sistemas biológicos intactos.
Para los enfoques basados en células, la utilidad de la biología celular automatizada requiere un examen de cómo la automatización y la medición objetiva pueden mejorar la experimentación y la comprensión de las enfermedades. En primer lugar, elimina la influencia del investigador en la mayoría de los aspectos de la investigación en biología celular, pero no en todos, y en segundo lugar, hace posibles enfoques completamente nuevos.
En resumen, la biología celular clásica del siglo XX utilizó líneas celulares cultivadas en cultivo donde los experimentos se midieron usando métodos muy similares a los descritos aquí, pero allí el investigador tomó la decisión sobre qué se midió y cómo. A principios de la década de 1990, el desarrollo de cámaras CCD ( cámaras con dispositivos de carga acoplada ) para la investigación creó la oportunidad de medir características en imágenes de células, como cuánta proteína hay en el núcleo y cuánta afuera. Pronto siguieron mediciones sofisticadas utilizando nuevas moléculas fluorescentes, que se utilizan para medir propiedades celulares como las concentraciones de segundos mensajeros o el pH de los compartimentos celulares internos. El amplio uso de la proteína verde fluorescente, una molécula de proteína fluorescente natural de las medusas, aceleró la tendencia hacia la obtención de imágenes celulares como tecnología principal en biología celular. A pesar de estos avances, el investigador aún seleccionó la elección de qué celda tomar imágenes y qué datos presentar y cómo analizarlos.
Por analogía, si uno imagina un campo de fútbol y platos colocados sobre él, en lugar de mirarlos todos, el investigador elegiría un puñado cerca de la línea marcada y tendría que dejar el resto. En esta analogía, el campo es una placa de cultivo de tejidos y las placas son las células que crecen en ella. Si bien este fue un enfoque razonable y pragmático, la automatización de todo el proceso y el análisis hace posible el análisis de toda la población de células vivas, por lo que se puede medir todo el campo de fútbol.