En biología de sistemas , las imágenes de células individuales vivas son una técnica de imágenes de células vivas que combina técnicas tradicionales de imágenes de células vivas y microscopía de lapso de tiempo con seguimiento celular automatizado y extracción de características, aprovechando muchas técnicas de detección de alto contenido . Se utiliza para estudiar la dinámica de señalización y el comportamiento en poblaciones de células vivas individuales. [1] [2] Los estudios unicelulares vivos pueden revelar comportamientos clave que de otro modo quedarían enmascarados en experimentos de promedio de población, como las transferencias Western . [3]
En un experimento de imágenes unicelulares vivas, se introduce un indicador fluorescente en una línea celular para medir los niveles, la localización o la actividad de una molécula de señalización. Posteriormente, se obtienen imágenes de una población de células a lo largo del tiempo con un cuidadoso control atmosférico para mantener la viabilidad y reducir el estrés sobre las células. Luego se realiza un seguimiento celular automatizado de estas imágenes de series temporales, tras lo cual se puede realizar el filtrado y el control de calidad. El análisis de las características que describen el indicador fluorescente a lo largo del tiempo puede conducir a la modelización y generación de conclusiones biológicas a partir de las cuales se pueden guiar más experimentos.
El campo de las imágenes unicelulares vivas comenzó con un trabajo que demostraba que la proteína verde fluorescente (GFP), que se encuentra en la medusa Aequorea victoria , podía expresarse en organismos vivos. [4] Este descubrimiento permitió a los investigadores estudiar la localización y los niveles de proteínas en células individuales vivas, por ejemplo, la actividad de las quinasas , [5] y los niveles de calcio , mediante el uso de reporteros FRET , [6] así como muchos otros fenotipos. . [7]
Generalmente, estos primeros estudios se centraron en la localización y el comportamiento de estas proteínas marcadas con fluorescencia a nivel subcelular durante cortos períodos de tiempo. Sin embargo, esto cambió con estudios pioneros que observaron el supresor de tumores p53 [8] y la proteína NF-κB relacionada con el estrés y la inflamación , [9] que revelaron que sus niveles y localización, respectivamente, oscilan durante períodos de varias horas. En esta época también se aplicaron enfoques de células unicelulares vivas para comprender la señalización en organismos unicelulares, incluidas las bacterias, donde los estudios en vivo permitieron modelar la dinámica de la competencia, [10] y la levadura reveló el mecanismo que sustenta la entrada coherente al ciclo celular. [11]
En cualquier estudio unicelular vivo, el primer paso es introducir un indicador de nuestra proteína/molécula de interés en una línea celular adecuada. Gran parte del crecimiento en este campo se debe a herramientas mejoradas de edición de genes como CRISPR , lo que condujo al desarrollo de una amplia variedad de reporteros fluorescentes. [12]
El etiquetado fluorescente utiliza un gen que codifica una proteína fluorescente que se inserta en el marco de codificación de la proteína que se va a etiquetar. Las características de textura e intensidad se pueden extraer de imágenes de la proteína marcada.
Las moléculas también pueden marcarse in vitro e introducirse en la célula mediante electroforesis . Esto permite el uso de fluoróforos más pequeños y fotoestables, pero requiere pasos de lavado adicionales. [13]
Al diseñar la expresión del indicador FRET de manera que los fluoróforos donante y emisor solo estén muy cerca cuando una molécula de señalización aguas arriba está activa o inactiva, la relación de intensidad de fluorescencia del donante al emisor se puede utilizar como una medida de la actividad de señalización. Por ejemplo, en trabajos iniciales clave que utilizaron reporteros FRET para estudios individuales en vivo, se diseñaron reporteros FRET de la actividad Rho GTPasa . [14]
Los reporteros de translocación nuclear utilizan señales de importación y exportación nucleares diseñadas , que pueden ser inhibidas por moléculas de señalización, para registrar la actividad de señalización a través de la proporción entre el reportero nuclear y el reportero citoplasmático. [15]
Luego se deben realizar imágenes de células vivas de células marcadas con fluorescencia. Esto requiere la incubación simultánea de células en condiciones libres de estrés mientras se realizan las imágenes. Hay varios factores que se deben tener en cuenta al elegir las condiciones de imagen, como la fototoxicidad, el fotoblanqueo , la facilidad de seguimiento, la tasa de cambio de la actividad de señalización y la relación señal-ruido. Todos estos se relacionan con la frecuencia de las imágenes y la intensidad de la iluminación.
La fototoxicidad puede resultar de la exposición a grandes cantidades de luz durante largos períodos de tiempo. Las células se estresarán, lo que puede provocar apoptosis. Las imágenes de alta frecuencia e intensidad pueden hacer que la señal del fluoróforo disminuya mediante el fotoblanqueo. Las imágenes de mayor frecuencia generalmente facilitan el seguimiento celular automatizado. Las frecuencias de imágenes deberían poder capturar los cambios necesarios en la actividad de señalización. Las imágenes de baja intensidad o los reporteros deficientes pueden impedir que se detecten niveles bajos de actividad de señalización dentro de la célula.
Después de obtener imágenes de células vivas, se emplea un software de seguimiento automatizado para extraer datos de series temporales de vídeos de células. El seguimiento de células vivas generalmente se divide en dos pasos: segmentación de imágenes de las células o sus núcleos y seguimiento de células/núcleos basado en estos segmentos. Todavía existen muchos desafíos en esta etapa de un estudio de imágenes unicelulares vivas. [16] Sin embargo, se han destacado avances recientes en el campo de la primera comparación objetiva de técnicas de seguimiento unicelular. [17]
Las imágenes de fase cuantitativa (QPI) son particularmente útiles para el seguimiento de células vivas. Como QPI no tiene etiquetas, no induce fototoxicidad ni sufre el fotoblanqueo asociado con las imágenes de fluorescencia. [18] QPI ofrece un contraste significativamente mayor que las técnicas de imágenes de fase convencionales, como la microscopía de contraste de fase . El mayor contraste facilita una segmentación y un seguimiento celular más sólidos que los que se pueden lograr con imágenes de fase convencionales. [19]
También se están utilizando cada vez más nuevas técnicas que utilizan una combinación de técnicas tradicionales de segmentación de imágenes y aprendizaje profundo para segmentar células. [20]
En la etapa final de un estudio de imágenes unicelulares en vivo, se realiza el modelado y análisis de datos de series temporales extraídos de las células rastreadas. Se pueden construir perfiles de árboles genealógicos para revelar la heterogeneidad en la respuesta celular individual y la señalización posterior. [21] [22] Refinar y comprimir datos del seguimiento unicelular basado en video puede proporcionar entradas relevantes para el análisis de big data, contribuyendo a la identificación de biomarcadores para mejorar el diagnóstico y el pronóstico. [23] Existe una gran superposición entre el análisis de datos vivos unicelulares y el modelado de sistemas biológicos utilizando ecuaciones diferenciales ordinarias . Los resultados de este paso clave del análisis de datos impulsarán una mayor experimentación, por ejemplo, perturbando aspectos del sistema que se está estudiando y luego comparando la dinámica de señalización con la de la población de control.
Al analizar la dinámica de señalización de células individuales en poblaciones enteras, los estudios de células individuales vivas ahora nos permiten comprender cómo estas dinámicas afectan los procesos clave de toma de decisiones celulares. Por ejemplo, los estudios unicelulares vivos del factor de crecimiento ERK revelaron que posee activación digital de todo o nada. [24] Además, esta activación de todo o nada era pulsátil, y la frecuencia de los pulsos, a su vez, determinaba si las células de los mamíferos se comprometerían a entrar en el ciclo celular o no. En otro ejemplo clave, los estudios unicelulares vivos de la actividad de CDK2 en células de mamíferos demostraron que la bifurcación en la actividad de CDK2 después de la mitosis determinaba si las células continuarían proliferando o entrarían en un estado de inactividad; [25] ahora se ha demostrado, utilizando métodos unicelulares vivos, que es causado por un daño estocástico en el ADN que induce una regulación positiva de p21 , que inhibe la actividad de CDK2. [26] En el futuro, los estudios unicelulares vivos probablemente ahora no cooperarán con múltiples reporteros en líneas unicelulares para permitir que se comprendan los procesos complejos de toma de decisiones; sin embargo, aún persisten desafíos en la ampliación de los estudios unicelulares vivos.