La caracterización de la bicapa lipídica es el uso de varios métodos de sondeo ópticos, químicos y físicos para estudiar las propiedades de las bicapas lipídicas. Muchas de estas técnicas son elaboradas y requieren equipos costosos porque la naturaleza fundamental de la bicapa lipídica la convierte en una estructura muy difícil de estudiar. Una bicapa individual, dado que tiene sólo unos pocos nanómetros de espesor, es invisible en la microscopía óptica tradicional. La bicapa también es una estructura relativamente frágil ya que se mantiene unida enteramente mediante enlaces no covalentes y se destruye irreversiblemente si se retira del agua. A pesar de estas limitaciones, durante los últimos setenta años se han desarrollado decenas de técnicas para permitir investigaciones de la estructura y función de las bicapas. El primer enfoque general fue utilizar mediciones in situ no destructivas , como la difracción de rayos X y la resistencia eléctrica, que midieron las propiedades de la bicapa pero en realidad no obtuvieron imágenes de la bicapa. Posteriormente se desarrollaron protocolos para modificar la bicapa y permitir su visualización directa al principio en el microscopio electrónico y, más recientemente, con microscopía de fluorescencia . Durante las últimas dos décadas, una nueva generación de herramientas de caracterización, incluido el AFM, ha permitido el sondeo directo y la obtención de imágenes de membranas in situ con poca o ninguna modificación química o física. Más recientemente, se ha utilizado la interferometría de polarización dual para medir la birrefringencia óptica de las bicapas lipídicas para caracterizar el orden y la alteración asociados con interacciones o efectos ambientales.
La microscopía de fluorescencia es una técnica mediante la cual ciertas moléculas pueden excitarse con una longitud de onda de luz y emitirán otra longitud de onda de luz más larga. Debido a que cada molécula fluorescente tiene un espectro único de absorción y emisión , se puede determinar la ubicación de tipos particulares de moléculas. Los lípidos naturales no son fluorescentes, por lo que siempre es necesario incluir una molécula de tinte para poder estudiar las bicapas lipídicas con microscopía de fluorescencia. Hasta cierto punto, la adición de la molécula de tinte siempre cambia el sistema y, en algunos casos, puede resultar difícil decir si el efecto observado se debe a los lípidos, al tinte o, más comúnmente, a alguna combinación de ambos. El tinte suele estar unido a un lípido o a una molécula que se parece mucho a un lípido, pero como el dominio del tinte es relativamente grande, puede alterar el comportamiento de esta otra molécula. Este es un tema particularmente polémico cuando se estudia la difusión o separación de fases de lípidos, ya que ambos procesos son muy sensibles al tamaño y la forma de las moléculas involucradas.
Esta posible complicación ha dado un argumento en contra del uso de uno de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) para determinar los coeficientes de difusión de bicapa. En un experimento FRAP típico, se fotoblanquea un área pequeña (~ 30 μm de diámetro) mediante exposición a una fuente de luz intensa. Luego, esta área se monitorea a lo largo del tiempo a medida que las moléculas de tinte "muertas" se difunden y son reemplazadas por moléculas de tinte intactas de la bicapa circundante. Ajustando esta curva de recuperación es posible calcular el coeficiente de difusión de la bicapa. [1] [2] Un argumento en contra del uso de esta técnica es que lo que realmente se está estudiando es la difusión del tinte, no del lípido. [3] Si bien es correcta, esta distinción no siempre es importante, ya que la movilidad del tinte a menudo está dominada por la movilidad de la bicapa.
En la microscopía de fluorescencia tradicional la resolución se ha limitado a aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada. Mediante el uso de microscopía confocal y procesamiento de imágenes, este límite se puede ampliar, pero normalmente no mucho menos de 100 nanómetros, que es mucho más pequeño que una célula típica pero mucho más grande que el espesor de una bicapa lipídica. Más recientemente, los métodos de microscopía avanzados han permitido una resolución mucho mayor en determinadas circunstancias, incluso hasta sub-nm. Uno de los primeros métodos desarrollados fue la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET). En FRET, se eligen dos moléculas de tinte de manera que el espectro de emisión de una se superponga al espectro de absorción de la otra. Esta transferencia de energía depende en gran medida de la distancia, por lo que es posible saber con una resolución de angstrom qué tan separados están los dos tintes. Esto se puede utilizar, por ejemplo, para determinar cuándo se fusionan dos bicapas y se mezclan sus componentes. [4] Otra técnica de microscopía de alta resolución es la microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia (FLIC). Este método requiere que la muestra se monte sobre una superficie reflectante micromecanizada con precisión. Al estudiar los patrones de interferencia destructiva formados, es posible resolver individualmente las dos valvas de una bicapa soportada y determinar la distribución de un tinte fluorescente en cada una. [5]
Las mediciones eléctricas son la forma más sencilla de caracterizar una de las funciones más importantes de una bicapa, es decir, su capacidad para segregar e impedir el flujo de iones en solución. En consecuencia, la caracterización eléctrica fue una de las primeras herramientas utilizadas para estudiar las propiedades de sistemas modelo como las membranas negras. Ya se sabía que la membrana celular era capaz de soportar un gradiente iónico y que este gradiente es responsable de la capacidad de las neuronas de enviar señales a través de un potencial de acción . Demostrar que fenómenos similares podían replicarse in vitro fue una verificación importante de la utilidad de los sistemas modelo. [6]
Fundamentalmente, todas las mediciones eléctricas de bicapas implican la colocación de un electrodo a cada lado de la membrana. Aplicando una polarización a través de estos electrodos y midiendo la corriente resultante, es posible determinar la resistencia de la bicapa. Esta resistencia suele ser bastante alta para bicapas intactas, y a menudo supera los 100 GΩ, ya que el núcleo hidrófobo es impermeable a especies hidratadas cargadas. Debido a que esta resistencia es tan grande, la presencia de incluso unos pocos agujeros a escala nanométrica produce un aumento dramático en la corriente y puede determinarse fácilmente. [7] La sensibilidad de este sistema es tal que incluso se puede resolver la actividad de canales iónicos individuales. [8] En tales mediciones de CC, es necesario utilizar electrodos electroquímicamente activos para proporcionar las cargas positivas necesarias en un lado y las cargas negativas en el otro. El sistema más común es el electrodo de plata/cloruro de plata, ya que esta reacción es estable, reversible, implica una transferencia de un solo electrón y puede producir grandes corrientes. [9] Además de las mediciones simples de corriente CC, también es posible realizar una caracterización eléctrica de CA para extraer información sobre la capacitancia y la impedancia compleja de una bicapa. Debido a que la capacitancia es inversamente proporcional al espesor y las bicapas son muy delgadas, normalmente tienen una capacitancia muy grande, del orden de 2 μF/cm 2 . Las mediciones de capacitancia son particularmente útiles cuando se trata de membranas lipídicas negras, ya que pueden usarse para determinar cuándo el tapón de solvente/lípido se adelgaza hasta convertirse en una sola bicapa.
Los lípidos son moléculas altamente polares que cuando se autoensamblan en bicapas crean una capa altamente birrefringente [10] donde las propiedades ópticas paralelas son muy diferentes de las perpendiculares. Este efecto, estudiado mediante interferometría de polarización dual, se ha utilizado para medir la reorganización dinámica de la capa debido a la temperatura, la fuerza iónica y las interacciones moleculares con, por ejemplo, péptidos antimicrobianos.
Las bicapas hidratadas muestran una rica dinámica vibratoria y son buenos medios para una transferencia eficiente de energía vibratoria. Las propiedades vibratorias de las monocapas y bicapas lipídicas se han investigado mediante técnicas espectroscópicas ultrarrápidas [11] y métodos computacionales desarrollados recientemente. [12]
La microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha utilizado en los últimos años para obtener imágenes y probar las propiedades físicas de las bicapas lipídicas. AFM es una técnica prometedora porque tiene el potencial de generar imágenes con resolución nanométrica a temperatura ambiente e incluso bajo el agua, condiciones necesarias para el comportamiento natural de la bicapa. Estas capacidades han permitido obtener imágenes directas de la sutil transición de fase de ondulación en una bicapa soportada. [13] Otro experimento de AFM realizado en modo de golpeteo en un medio tampón acuoso permitió (1) determinar la formación de poros (agujeros) transmembrana alrededor de nanopartículas de aproximadamente 1,2 a 22 nm de diámetro mediante la sustracción de imágenes de AFM de series registradas durante la bicapa lipídica. formación y (2) observar la adsorción de moléculas individuales de insulina en nanopartículas expuestas. [14] Otra ventaja es que AFM no requiere marcaje fluorescente o isotópico de los lípidos, ya que la punta de la sonda interactúa mecánicamente con la superficie de la bicapa. Debido a esto, la misma exploración puede revelar información tanto sobre la bicapa como sobre cualquier estructura asociada, incluso hasta el punto de resolver proteínas de membrana individuales. [15] Además de las imágenes, el AFM también puede investigar la naturaleza mecánica de pequeñas estructuras delicadas, como las bicapas lipídicas. Un estudio demostró la posibilidad de medir el módulo elástico de membranas individuales a nanoescala suspendidas sobre alúmina anódica porosa. [dieciséis]
Aunque AFM es una herramienta potente y versátil para estudiar las bicapas lipídicas, existen algunas limitaciones y dificultades prácticas. Debido a la naturaleza frágil de la bicapa, se deben utilizar fuerzas de escaneo extremadamente bajas (normalmente 50 pN o menos [13] [17] ) para evitar daños. Esta consideración es particularmente importante cuando se estudian sistemas metaestables, como vesículas adsorbidas en un sustrato, ya que la punta del AFM puede inducir ruptura y otros cambios estructurales. [18] También se debe tener cuidado al elegir un material y una preparación de superficie adecuados para la punta del AFM, ya que las superficies hidrofóbicas pueden interactuar fuertemente con los lípidos y alterar la estructura bicapa. [19]
En la microscopía electrónica, un haz de electrones enfocados interactúa con la muestra en lugar de un haz de luz como en la microscopía tradicional. Los electrones tienen una longitud de onda mucho más corta que la luz, por lo que la microscopía electrónica tiene una resolución mucho mayor que la microscopía óptica, potencialmente hasta la escala atómica. Debido a que las bicapas lipídicas están dispuestas a nivel molecular, esta mayor resolución ha sido invaluable. En 1960, cuando todavía se debatía la estructura de la bicapa, fue la microscopía electrónica la que ofreció la primera visualización directa de las dos valvas superpuestas. [20] Junto con las técnicas de congelación rápida, la microscopía electrónica también se ha utilizado para estudiar los mecanismos de transporte intercelular e intracelular, por ejemplo para demostrar que las vesículas exocitóticas son el medio de liberación química en las sinapsis . [21] A menudo, la microscopía electrónica es la única técnica de sonda con resolución suficiente para determinar morfologías complejas a escala nanométrica.
Las limitaciones de la microscopía electrónica en el estudio de las estructuras lipídicas tienen que ver principalmente con la preparación de muestras. La mayoría de los microscopios electrónicos requieren que la muestra esté al vacío, lo que es incompatible con la hidratación a temperatura ambiente. Para superar este problema, se pueden obtener imágenes de las muestras en condiciones criogénicas con el agua asociada congelada, o se puede hacer un negativo metálico a partir de una muestra congelada. También suele ser necesario teñir la bicapa con un compuesto de metal pesado como tetróxido de osmio o acetato de uranilo porque los constituyentes de bajo peso atómico de los lípidos (carbono, nitrógeno, fósforo, etc.) ofrecen poco contraste en comparación con el agua. Si se utiliza un microscopio electrónico de transmisión (TEM), también es necesario cortar o pulir la muestra en una lámina muy delgada (<1 micrómetro), lo que puede resultar difícil y llevar mucho tiempo. La microscopía electrónica de barrido (SEM) no requiere este paso, pero no puede ofrecer la misma resolución que la TEM. Ambos métodos son técnicas sensibles a la superficie y no pueden revelar información sobre estructuras profundamente enterradas.
Tanto los rayos X como los neutrones de alta energía se utilizan para investigar la estructura y la periodicidad de las estructuras biológicas, incluidas las bicapas, porque pueden ajustarse para interactuar con la materia en las escalas de longitud relevantes (angstrom-nm). A menudo, estas dos clases de experimentos proporcionan información complementaria porque cada una tiene diferentes ventajas y desventajas. Los rayos X interactúan sólo débilmente con el agua, por lo que las muestras a granel pueden sondearse con una preparación de muestra relativamente sencilla. Ésta es una de las razones por las que la dispersión de rayos X fue la técnica utilizada por primera vez para estudiar sistemáticamente el espaciamiento entre bicapas. [22] La dispersión de rayos X también puede proporcionar información sobre el espaciado promedio entre moléculas de lípidos individuales , lo que ha llevado a su uso para caracterizar las transiciones de fase . [23] Una limitación de las técnicas de rayos X es que los rayos X son relativamente insensibles a elementos ligeros como el hidrógeno. Este efecto es una consecuencia del hecho de que los rayos X interactúan con la materia dispersando la densidad electrónica, que disminuye al disminuir el número atómico. Por el contrario, los neutrones se dispersan a partir de la densidad nuclear y los campos magnéticos nucleares, por lo que la sensibilidad no disminuye monótonamente con z . Este mecanismo también proporciona un fuerte contraste isotópico en algunos casos, en particular entre hidrógeno y deuterio , lo que permite a los investigadores ajustar la línea de base experimental mezclando agua y agua deuterada. El uso de reflectometría en lugar de dispersión con neutrones o rayos X permite a los experimentadores sondear bicapas o pilas multicapa soportadas. Estas mediciones son más complicadas de realizar un análisis, pero permiten la determinación de la composición de la sección transversal, incluida la ubicación y concentración de agua dentro de la bicapa. [24] En el caso de las mediciones de dispersión de neutrones y rayos X, la información proporcionada es un promedio conjunto del sistema y, por lo tanto, está sujeta a incertidumbre basada en las fluctuaciones térmicas en estas estructuras altamente móviles. [25]