En óptica , el fotoblanqueo (a veces denominado desvanecimiento) es la alteración fotoquímica de un tinte o una molécula de fluoróforo de tal manera que no puede fluorescer de forma permanente. Esto es causado por la ruptura de enlaces covalentes o reacciones no específicas entre el fluoróforo y las moléculas circundantes. [1] [2] Estas modificaciones irreversibles en los enlaces covalentes son causadas por la transición de un estado singlete al estado triplete de los fluoróforos. El número de ciclos de excitación para lograr un blanqueo completo varía. En microscopía , el fotoblanqueo puede complicar la observación de moléculas fluorescentes, ya que eventualmente serán destruidas por la exposición a la luz necesaria para estimularlas a fluorescer. Esto es especialmente problemático en la microscopía de lapso de tiempo .
Sin embargo, también se puede utilizar el fotoblanqueo antes de aplicar las moléculas fluorescentes (principalmente ligadas a anticuerpos ), en un intento de extinguir la autofluorescencia . Esto puede ayudar a mejorar la relación señal-ruido .
El fotoblanqueo también se puede aprovechar para estudiar el movimiento y/o la difusión de moléculas, por ejemplo a través de FRAP , en el que el movimiento de los componentes celulares se puede confirmar observando una recuperación de la fluorescencia en el sitio del fotoblanqueo, o técnicas FLIP , en las que se realizan múltiples rondas de fotoblanqueo de modo que se pueda observar la propagación de la pérdida de fluorescencia en la célula.
La pérdida de actividad causada por el fotoblanqueo se puede controlar reduciendo la intensidad o el tiempo de exposición a la luz, aumentando la concentración de fluoróforos, reduciendo la frecuencia y, por lo tanto, la energía de los fotones de la luz de entrada, o empleando fluoróforos más robustos que sean menos propensos al blanqueamiento (por ejemplo, colorantes de cianina, fluoruros Alexa o fluoruros DyLight , colorantes AttoDyes, colorantes Janelia y otros). En una aproximación razonable, una molécula dada se destruirá después de una exposición constante (intensidad de emisión X tiempo de emisión X número de ciclos) porque, en un entorno constante, cada ciclo de absorción-emisión tiene la misma probabilidad de causar fotoblanqueo.
El fotoblanqueo es un parámetro importante a tener en cuenta en la obtención de imágenes de fluorescencia de moléculas individuales en tiempo real en biofísica . A las intensidades de luz utilizadas en la obtención de imágenes de fluorescencia de moléculas individuales (0,1-1 kW/cm2 en configuraciones experimentales típicas), incluso los fluoróforos más robustos continúan emitiendo hasta 10 segundos antes de fotoblanquearse en un solo paso. En el caso de algunos colorantes, la vida útil se puede prolongar entre 10 y 100 veces utilizando sistemas de depuración de oxígeno (hasta 1000 segundos con optimización de los parámetros de obtención de imágenes y la relación señal-ruido). Por ejemplo, a menudo se utiliza una combinación de ácido protocatéquico (PCA) y protocatecuato 3,4-dioxigenasa (PCD) como sistema de depuración de oxígeno, y eso aumenta la vida útil de la fluorescencia en más de un minuto.
Dependiendo de su química específica, las moléculas pueden fotoblanquearse después de absorber solo unos pocos fotones, mientras que las moléculas más robustas pueden atravesar muchos ciclos de absorción/emisión antes de su destrucción:
Este uso del término "vida útil" no debe confundirse con la "vida útil" medida mediante imágenes de vida útil de fluorescencia .