En óptica , el fotoblanqueo (a veces denominado desvanecimiento) es la alteración fotoquímica de un tinte o una molécula de fluoróforo de modo que sea permanentemente incapaz de emitir fluorescencia. Esto se debe a la rotura de enlaces covalentes o reacciones no específicas entre el fluoróforo y las moléculas circundantes. [1] [2] Estas modificaciones irreversibles en los enlaces covalentes son causadas por la transición de un estado singlete al estado triplete de los fluoróforos. El número de ciclos de excitación para lograr un blanqueo completo varía. En microscopía , el fotoblanqueo puede complicar la observación de moléculas fluorescentes, ya que eventualmente serán destruidas por la exposición a la luz necesaria para estimularlas a fluorescer. Esto es especialmente problemático en microscopía de lapso de tiempo .
Sin embargo, también se puede utilizar el fotoblanqueo antes de aplicar las moléculas fluorescentes (principalmente unidas a anticuerpos ), en un intento de apagar la autofluorescencia . Esto puede ayudar a mejorar la relación señal-ruido .
El fotoblanqueo también se puede aprovechar para estudiar el movimiento y/o la difusión de moléculas, por ejemplo mediante FRAP , en el que el movimiento de los componentes celulares se puede confirmar observando una recuperación de la fluorescencia en el sitio del fotoblanqueo, o técnicas FLIP , en las que múltiples Se realizan rondas de fotoblanqueo para poder observar la propagación de la pérdida de fluorescencia en la célula.
La pérdida de actividad causada por el fotoblanqueo se puede controlar reduciendo la intensidad o el tiempo de exposición a la luz, aumentando la concentración de fluoróforos, reduciendo la frecuencia y, por tanto, la energía fotónica de la luz de entrada, o empleando fluoróforos más robustos que sean menos propensos a la decoloración (por ejemplo, tintes de cianina, Alexa Fluors o DyLight Fluors , AttoDyes, Janelia Dyes y otros). En una aproximación razonable, una molécula dada será destruida después de una exposición constante (intensidad de emisión X tiempo de emisión X número de ciclos) porque, en un ambiente constante, cada ciclo de absorción-emisión tiene la misma probabilidad de causar fotoblanqueo.
"El fotoblanqueo es un parámetro importante a tener en cuenta en la obtención de imágenes de fluorescencia de una sola molécula en tiempo real en biofísica ". A las intensidades de luz utilizadas en las imágenes de fluorescencia de una sola molécula (0,1-1 kW/cm 2 en configuraciones experimentales típicas), incluso los fluoróforos más robustos continúan emitiendo durante hasta 10 segundos antes del fotoblanqueo en un solo paso. Para algunos tintes, la vida útil se puede prolongar entre 10 y 100 veces utilizando sistemas de eliminación de oxígeno (hasta 1000 segundos con optimización de los parámetros de imagen y la relación señal-ruido). Por ejemplo, a menudo se utiliza una combinación de ácido protocatequiico (PCA) y protocatecuato 3,4-dioxigenasa (PCD) como sistema de eliminación de oxígeno, lo que aumenta la vida útil de la fluorescencia en más de un minuto.
Dependiendo de su química específica, las moléculas pueden fotoblanquearse después de absorber solo unos pocos fotones, mientras que las moléculas más robustas pueden sufrir muchos ciclos de absorción/emisión antes de su destrucción:
Este uso del término "vida útil" no debe confundirse con la "vida útil" medida mediante imágenes de vida útil por fluorescencia .