En biología molecular , una caja CCAAT (a veces también abreviada como caja CAAT o caja CAT ) es un patrón distinto de nucleótidos con una secuencia consenso GGCCAATCT que se encuentra aguas arriba entre 60 y 100 bases hasta el sitio de transcripción inicial . La caja CAAT señala el sitio de unión para el factor de transcripción de ARN y normalmente va acompañada de una secuencia consenso conservada . Es una secuencia de ADN invariante a aproximadamente menos 70 pares de bases del origen de la transcripción en muchos promotores eucarióticos . Los genes que tienen este elemento parecen requerirlo para que el gen se transcriba en cantidades suficientes. Con frecuencia está ausente en los genes que codifican proteínas utilizadas en prácticamente todas las células. Este cuadro, junto con el cuadro GC, es conocido por unir factores de transcripción generales. Ambas secuencias consenso pertenecen al promotor regulador . La expresión genética completa se produce cuando las proteínas activadoras de la transcripción se unen a cada módulo dentro del promotor regulador. Se requiere unión específica a proteínas para la activación de la caja CCAAT. Estas proteínas se conocen como proteínas de unión a la caja CCAAT/factores de unión a la caja CCAAT.
Una caja CCAAT es una característica que se encuentra frecuentemente antes de las regiones codificantes de los eucariotas, pero no se encuentra en los procariotas. [2]
En la dirección de transcripción de la cadena plantilla, la secuencia consenso , o el orden calculado de los residuos más frecuentes, para la caja CAAT fue 3'-TG ATTGG (T/C)(T/C)(A/G)- 5'. El uso de paréntesis indica que cualquiera de las bases está presente, pero no se especifica sus frecuencias relativas. Por ejemplo, "(T/C)" significaría que se seleccionan preferentemente timina o citosina. [3] Dentro de los metazoos (reino animal), el complejo de ADN-factor de unión central (CBF) conserva un alto grado de conservación dentro del motivo de unión CCAAT, así como las secuencias que flanquean este motivo pentamérica. El motivo CCAAT en las plantas (se utilizaron espinacas en un experimento) difiere ligeramente de los metazoos en que en realidad es un motivo de unión a CAAT; el promotor carece de uno de los dos residuos C del motivo pentamérica y la adición artificial de la segunda C no tiene efectos significativos sobre la actividad de unión. Algunas secuencias carecen por completo de la caja CAAT. En segundo lugar, los nucleótidos circundantes en las plantas no coinciden con la secuencia consenso determinada anteriormente por Bi et al. [4]
La caja CAAT es lo que se conoce como promotor central, también conocido como promotor basal o simplemente promotor , es una región del ADN que inicia la transcripción de un gen en particular. Esta región, en particular para la caja CAAT, se encuentra a unas 60-100 bases aguas arriba (hacia el extremo 5'), pero a no menos de 27 pares de bases del sitio de transcripción inicial o de un gen eucariota en el que se encuentra un complejo de genes eucariotas. Los factores de transcripción se unen a la ARN polimerasa II antes del inicio de la transcripción. [5] [6] Es esencial para la transcripción que estos factores de unión centrales (también conocidos como factor nuclear Y o NF-Y) sean capaces de unirse al motivo CCAAT. Experimentos en muchos laboratorios han demostrado que las mutaciones en el motivo CCAAT que causan una pérdida de unión a CBF también disminuyen la actividad transcripcional en estos promotores, lo que sugiere que los complejos CBF-CCAAT son esenciales para una actividad transcripcional óptima. [3]
En un experimento realizado con factores de unión central (CBF) y complejos de ADN, los investigadores pudieron determinar las secuencias preferenciales del promotor en una región inmediatamente adyacente a la caja CAAT, y dos regiones a cada lado de la caja CAAT. Mediante el uso del proceso de selección de unión aleatoria mediado por PCR , los investigadores pudieron demostrar que la secuencia "3' - (T/C)G ATTGG (T/C)(T/C)(A/G) - 5'" que flanquea inmediatamente la región ATTGG (CCAAT en la cadena complementaria) se seleccionó preferentemente en la cadena codificante (opuesta a la cadena plantilla). [3] [7] [8] Esto se demostró utilizando una secuencia de oligonucleótidos (R1) que contenía 27 nucleótidos aleatorios, flanqueados por una secuencia definida de 20 nucleótidos en cada lado. Si bien no se seleccionó ningún nucleótido en cada clon a ambos lados del motivo ATTGG (CCAAT en la cadena complementaria), hubo varios nucleótidos en posiciones seleccionadas con alta frecuencia. Lo más notable de la secuencia anterior fue el residuo G hacia el extremo 5' de ATTGG. Los demás residuos enumerados también fueron notables, pero hay una división entre dos residuos. Este mismo experimento también produjo la misma secuencia que se muestra arriba cuando se usó un oligonucleótido diferente (R2) que contenía un núcleo ATTGG y flanqueado por 12 nucleótidos aleatorios en 5' y 10 nucleótidos aleatorios en 3'. Ambas secuencias son muy similares y se confirman en múltiples experimentos. Para las secuencias que flanqueaban el motivo ATTGG con dos residuos de adenina (AA) en su extremo 5' y G(A/G) en su extremo 3', parece haber inhibido la formación del complejo CBF-ADN y posteriormente ocurrió en solo el 1%. de las secuencias promotoras. [3] En otro experimento realizado con el promotor tardío principal (MLP) de adenovirus de una variedad de especies hospedadoras, se demostró que la mutación de la caja CAAT y la secuencia CCAAT, que se cree que desempeña un papel fundamental en la (MLP ) de adenovirus humanos del subgrupo C, en especies con una secuencia CAAT deficiente. El inicio de la transcripción en especies MLP mutantes se redujo significativamente en comparación con el tipo salvaje o especies en las que había un mutante CAAT. La imposibilidad de restaurar los adenovirus normalmente funcionales, exhibida por una caja CAAT, es consistente con la idea de que la caja CAAT desempeña un papel vital en el adenovirus MLP y se prefiere a otros elementos transcripcionales. [9]
Estos factores de unión centrales, o factores nucleares (NF-Y), están compuestos de tres subunidades: NF-YA, NF-YB y NF-YC. Mientras que en los animales cada subunidad NF-Y está codificada por un solo gen, en las plantas ha habido una diversificación tanto en estructura como en función. Las familias de NF-Y constan de entre ocho y 39 miembros por subunidad. Una razón importante para esta diversificación es la duplicación de genes y las duplicaciones en tándem, que han contribuido a que las familias de NF-Y sean más grandes en comparación con los factores nucleares animales codificados de forma única. [10] Cada subunidad contiene una parte conservada evolutivamente: el C-terminal de NF-YA, la parte central de NF-YB y el N-terminal de NF-YC; más del 70% de estos en todas las especies permanecen conservados. Sin embargo, las regiones vecinas generalmente no se conservan. [6]
La familia NF-YA codifica factores de transcripción de longitud variable (entre 207 y 347 aminoácidos para M. truncatula ). Las proteínas NF-YA se caracterizan generalmente por dos dominios que están fuertemente conservados en todos los eucariotas superiores investigados hasta la fecha. El primer dominio (A1) contiene 20 aminoácidos que forman una hélice alfa que parece significativa en sus interacciones con NF-YB y NF-YC. El segundo dominio (A2) es adyacente al dominio A1 mediante una secuencia conectora conservada que es una secuencia de 21 aminoácidos vitales en la unión específica del ADN a la caja CCAAT. Los dominios A1 y A2 se conservan hacia el extremo C de los mamíferos, pero ocupan una región más central en las subunidades NF-YA de las plantas. En las plantas, la subunidad NF-YA ha evolucionado para regular el desarrollo de un órgano radicular facultativo que solo está presente en las leguminosas y que se ha demostrado que se expresa en el tejido de las raíces. Se demostró que tiene propiedades similares a las de resistencia a la sequía, y se regula positivamente durante el estrés por sequía en las raíces y hojas de Arabidopsis . Los mutantes de NF-YA han mostrado una pérdida de función y una hipersensibilidad a condiciones similares a la sequía y, por el contrario, la sobreexpresión de NF-YA ha resultado en resistencia a la sequía . [10]
La familia NF-YB es, similar a la subunidad NF-YA, de longitud variable, sin embargo, en promedio es mucho más pequeña que la subunidad NF-YA (90-240 aminoácidos en "M. truncatula"). Se han caracterizado con una estructura y composición de aminoácidos similar al motivo del pliegue de histonas (HFM). Está compuesto por tres hélices alfa separadas por dos dominios de bucle de cadena beta. Al igual que NF-YA, se ha demostrado que NF-YB también mejora la resistencia a la sequía cuando se sobreexpresa y también la promoción de la floración en Arabidopsis . [10]
Las proteínas NF-YC tienen un tamaño intermedio entre el de las proteínas NF-YA y NF-YB (117–292 aminoácidos en M. truncatula ) y también contienen el HFM que prevalece en las proteínas NF-YB. También se ha demostrado que participa en la época de floración en determinadas plantas (la sobreexpresión conduce a una floración más temprana), donde su influencia está potencialmente regulada por la unión de la proteína CONSTANS (CO) a la subunidad NF-YC. [10]
Debido al cambio evolutivo en los genes que codifican NF-Y en las plantas, éstas posteriormente tienen una amplia gama de complejos triméricos potenciales. Por ejemplo, en Arabidopsis se han identificado 36 subunidades del factor de transcripción NF-Y (incluidas 10 subunidades NF-YA, 13 NF-YB y 13 NF-YC) que teóricamente podrían formar 1690 complejos únicos (que contienen uno de cada tipo). de subunidad). Este número, por supuesto, es mayor de lo que realmente sucede, ya que algunas subunidades tienen patrones de unión específicos. Los análisis funcionales de los genes que codifican NF-Y en plantas han demostrado que, como resultado de su diversificación evolutiva en relación con sus homólogos animales, han adquirido diversas funciones específicas, como el desarrollo embrionario, el control del tiempo de floración, el estrés del RE, el estrés por sequía y la formación de nódulos. y desarrollo radicular. Esto puede ser sólo una pequeña parte de sus capacidades, ya que el número de combinaciones teóricas de complejos NF-Y es tan grande que en realidad sólo se puede crear una pequeña parte (menos del 10% de todas las interacciones posibles se confirmaron en ambas direcciones en la levadura). ). [10]
Otro aspecto del motivo de unión a CCAAT son las proteínas de unión a CCAAT/potenciadoras (C/EBP). Son un grupo de factores de transcripción de 6 miembros (α-ζ), que están altamente conservados y se unen al motivo CCAAT. Si bien la investigación sobre estas proteínas de unión es relativamente reciente, se ha demostrado que su función tiene funciones vitales en la proliferación y diferenciación celular, el metabolismo , la inflamación y la inmunidad en varias células, pero específicamente en los hepatocitos , los adipocitos y las células hematopoyéticas . [11] Por ejemplo, en los adipocitos, esto se ha demostrado en una variedad de experimentos con ratones: la expresión ectópica de estas C/EBP (C/EBPα y C/EBPβ) fueron capaces de iniciar los programas de diferenciación de la célula, incluso en la ausencia de hormonas adipogénicas , o la diferenciación de preadipocitos a adipocitos (o células grasas). Además, una sobreabundancia de estos C/EBP (específicamente, C/EBPδ) provoca una respuesta acelerada. Y además, en células que carecen de C/EBP o en ratones con deficiencia de C/EBP, ambas son incapaces de sufrir adipogénesis. Esto provoca que los ratones mueran por hipoglucemia o por la reducción de la acumulación de lípidos en el tejido adiposo. [12] Las C/EBP siguen un dominio general de cremallera básica de leucina (bZIP) en el extremo C-terminal y son capaces de formar dímeros con otras C/EBP u otros factores de transcripción. Esta dimerización permite que las C/EBP se unan específicamente al ADN a través de una secuencia palindrómica en el surco principal del ADN. Se regulan a través de diversos medios, incluidos hormonas , mitógenos , citocinas , nutrientes y otros factores diversos. [11]