La amplificación cíclica del plegamiento incorrecto de proteínas ( PMCA ) es una técnica de amplificación (conceptualmente similar a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pero que no involucra nucleótidos ) para multiplicar priones mal plegados desarrollada originalmente por Soto y colegas. [1] Es una prueba para encefalopatías espongiformes como la enfermedad de desgaste crónico (CWD) [2] o la encefalopatía espongiforme bovina (BSE).
La técnica incuba inicialmente una pequeña cantidad de prión anormal con un exceso de proteína normal, de modo que se produce cierta conversión. Luego, la cadena creciente de proteína mal plegada se somete a ultrasonidos , que la descomponen en cadenas más pequeñas y aumentan rápidamente la cantidad de proteína anormal disponible para provocar conversiones. [1] [3] Al repetir el ciclo, la masa de proteína normal se transforma rápidamente en el prión que se está analizando. [ cita requerida ]
La PMCA se desarrolló originalmente para imitar in vitro la replicación de priones con una eficiencia similar al proceso in vivo , pero con una cinética acelerada. [1] La PMCA es conceptualmente análoga a la reacción en cadena de la polimerasa: en ambos sistemas, una plantilla crece a expensas de un sustrato en una reacción cíclica, que combina el crecimiento y la multiplicación de las unidades de plantilla. [ cita requerida ]
La PMCA se ha aplicado para replicar la proteína mal plegada de diversas especies. [4] [5] [6] La proteína recién generada exhibe las mismas propiedades bioquímicas, biológicas y estructurales que la PrP Sc derivada del cerebro y, sorprendentemente, es infecciosa para los animales de tipo salvaje , produciendo una enfermedad con características similares a la enfermedad producida por los priones aislados del cerebro. [7]
La tecnología se ha automatizado, lo que ha permitido aumentar drásticamente la eficiencia de la amplificación. Ahora, un solo ciclo produce un aumento de 2500 veces en la sensibilidad de detección con respecto al Western blot, [8] mientras que 2 y 7 ciclos consecutivos producen aumentos de 6 millones y 3 mil millones de veces en la sensibilidad de detección con respecto al Western blot , una técnica ampliamente utilizada en la vigilancia de la EEB en varios países. [8]
Se ha demostrado que la PMCA es capaz de detectar tan sólo una molécula de PrP Sc infecciosa oligomérica . [8] La PMCA posee la capacidad de generar millones de unidades infecciosas, comenzando con el equivalente a un oligómero de PrP Sc ; muy por debajo del umbral de infectividad . [8] Estos datos demuestran que la PMCA tiene un poder de amplificación similar al de las técnicas de PCR utilizadas para amplificar el ADN. Abre una gran promesa para el desarrollo de una detección altamente sensible de PrP Sc y para comprender la base molecular de la replicación de priones. De hecho, varios grupos han utilizado la PMCA para detectar PrP Sc en la sangre de animales infectados experimentalmente con priones durante las fases sintomática [9] y presintomática [10] , así como en la orina. [11]
La tecnología PMCA ha sido utilizada por varios grupos para comprender el mecanismo molecular de la replicación priónica, la naturaleza del agente infeccioso, el fenómeno de las cepas priónicas y la barrera de especies, el efecto de los componentes celulares, para detectar PrP Sc en tejidos y fluidos biológicos y para detectar inhibidores contra la replicación priónica. [12] [13] [14] Estudios recientes de los grupos de Supattapone y Ma pudieron producir replicación priónica in vitro mediante PMCA utilizando PrP C purificada y PrP C recombinante con la única adición de polianiones y lípidos sintéticos . [15] [16] Estos estudios han demostrado que los priones infecciosos se pueden producir en ausencia de cualquier otro componente celular y constituyen algunas de las pruebas más sólidas a favor de la hipótesis priónica.
Una investigación de 2020 concluyó que la amplificación cíclica del plegamiento incorrecto de proteínas podría usarse para distinguir entre dos enfermedades neurodegenerativas progresivas, la enfermedad de Parkinson y la atrofia multisistémica , siendo el primer proceso en dar un diagnóstico objetivo de atrofia multisistémica en lugar de solo un diagnóstico diferencial. [17] [18]
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