Enzima que sintetiza ARN a partir de una plantilla de ARN.
La ARN polimerasa dependiente de ARN ( RdRp ) o ARN replicasa es una enzima que cataliza la replicación de ARN a partir de una plantilla de ARN. Específicamente, cataliza la síntesis de la cadena de ARN complementaria a un molde de ARN determinado. Esto contrasta con las típicas ARN polimerasas dependientes de ADN , que todos los organismos utilizan para catalizar la transcripción de ARN a partir de una plantilla de ADN .
RdRp es una proteína esencial codificada en los genomas de la mayoría de los virus que contienen ARN sin etapa de ADN [1] [2] , incluido el SARS-CoV-2 . Algunos eucariotas también contienen RdRps, que participan en la interferencia del ARN y se diferencian estructuralmente de los RdRps virales.
Historia
Los RdRps virales se descubrieron a principios de la década de 1960 a partir de estudios sobre mengovirus y virus de la polio cuando se observó que estos virus no eran sensibles a la actinomicina D , un fármaco que inhibe la síntesis de ARN dirigida por el ADN celular. Esta falta de sensibilidad sugirió que existe una enzima específica del virus que podría copiar el ARN de una plantilla de ARN y no de una plantilla de ADN. [3]
Distribución
Los RdRps están altamente conservados en todos los virus e incluso están relacionados con la telomerasa , aunque la razón de esto es una pregunta en curso desde 2009. [4] La similitud ha llevado a especular que los RdRps virales son ancestrales de la telomerasa humana. [5]
El ejemplo más famoso de RdRp es el del virus de la polio . El genoma viral está compuesto de ARN, que ingresa a la célula mediante endocitosis mediada por receptores . A partir de ahí, el ARN puede actuar como plantilla para la síntesis de ARN complementario de forma inmediata. La cadena complementaria es entonces capaz de actuar como plantilla para la producción de nuevos genomas virales que se empaquetan y liberan de la célula listos para infectar más células huésped. La ventaja de este método de replicación es que no existe una etapa de ADN; la replicación es rápida y fácil. La desventaja es que no existe una copia de ADN de "respaldo". [6]
RdRp se diferencia de la ARN polimerasa dependiente de ADN en que funciona para catalizar la síntesis de una cadena de ARN complementaria a una plantilla de ARN determinada, en lugar de utilizar una plantilla de ADN. El proceso de replicación del ARN es un mecanismo de cuatro pasos, como se describe.
Unión de nucleósido trifosfato (NTP): inicialmente, RdRp presenta un sitio activo vacante en el que se une un NTP, complementario al nucleótido correspondiente en la cadena plantilla. La unión NTP correcta hace que RdRp sufra un cambio conformacional. [11]
Cierre del sitio activo: el cambio conformacional, iniciado por la unión correcta de NTP, da como resultado la restricción del acceso al sitio activo y produce un estado catalíticamente competente. [11]
Formación de enlaces fosfodiéster : dos iones Mg 2+ están presentes en estado catalíticamente activo y se organizan de tal manera alrededor de la cadena de ARN recién sintetizada que el sustrato NTP puede sufrir una transferencia de fosfatidilo y formar un enlace fosfodiéster con la cadena recién sintetizada. . [12] Sin el uso de estos iones Mg 2+ , el sitio activo ya no es catalíticamente estable y el complejo RdRp cambia a una conformación abierta. [12]
Translocación: una vez que el sitio activo está abierto, la cadena plantilla de ARN puede moverse una posición a través del complejo proteico RdRp y continuar el alargamiento de la cadena uniéndose a un nuevo NTP, a menos que la plantilla especifique lo contrario. [11]
La síntesis de ARN se puede realizar mediante un mecanismo independiente del cebador ( de novo ) o dependiente del cebador que utiliza un cebador ligado al genoma de una proteína viral (VPg). [13] La iniciación de novo consiste en la adición de un nucleósido trifosfato (NTP) al 3'-OH del primer NTP iniciador. [13] Durante la siguiente fase de elongación, esta reacción de transferencia de nucleotidilo se repite con NTP posteriores para generar el producto de ARN complementario. La terminación de la cadena de ARN naciente producida por RdRp no se conoce completamente; sin embargo, se ha demostrado que la terminación de RdRp es independiente de la secuencia. [14]
Un inconveniente importante de la replicación de la ARN polimerasa dependiente de ARN es la inmensa tasa de error durante la transcripción. [13] Se sabe que los RdRps tienen una falta de fidelidad del orden de 10 4 nucleótidos, lo que se cree que es un resultado directo de sus insuficientes capacidades de corrección. [13] Esta alta tasa de variación se ve favorecida en los genomas virales, ya que permite que el patógeno supere las defensas desarrolladas por los huéspedes que intentan evitar la infección, lo que permite el crecimiento evolutivo. [15]
Estructura
Descripción general de la estructura RdRp del flavivirus basada en NS5Pol del virus del Nilo Occidental (WNV)
Las ARN polimerasas virales/procariotas dirigidas por ARN, junto con muchas polimerasas dirigidas por ADN de una sola subunidad, emplean un pliegue cuya organización se ha relacionado con la forma de la mano derecha con tres subdominios denominados dedos, palma y pulgar. [16] Sólo el subdominio de la palma, compuesto por una lámina beta antiparalela de cuatro cadenas con dos hélices alfa , está bien conservado entre todas estas enzimas. En RdRp, el subdominio palm comprende tres motivos bien conservados (A, B y C). El motivo A (Dx(4,5)-D) y el motivo C (GDD) están yuxtapuestos espacialmente; los residuos de ácido aspártico de estos motivos están implicados en la unión de Mg 2+ y/o Mn 2+ . El residuo de asparagina del motivo B participa en la selección de ribonucleósidos trifosfato sobre dNTP y, por tanto, determina si se sintetiza ARN en lugar de ADN. [17] La organización del dominio [18] y la estructura 3D del centro catalítico de una amplia gama de RdRps, incluso aquellos con una baja homología de secuencia general, se conservan. El centro catalítico está formado por varios motivos que contienen varios residuos de aminoácidos conservados. [ cita necesaria ]
La interferencia del ARN eucariota requiere una ARN polimerasa celular dependiente de ARN (c RdRp). A diferencia de las polimerasas "manuales", se parecen a las ARN polimerasas dependientes de ADN (DdRP) de múltiples subunidades simplificadas , específicamente en las subunidades catalíticas β/β', en el sentido de que utilizan dos conjuntos de barriles β de doble psi en el sitio activo. QDE1 ( Q9Y7G6 ) en Neurospora crassa , que tiene ambos barriles en la misma cadena, [19] es un ejemplo de dicha enzima ac RdRp. [20] Los homólogos de bacteriófagos de c RdRp, incluido el DdRp yonO de cadena sencilla similar ( O31945 ), parecen estar más cerca de c RdRps que los DdRP. [8] [21]
En virus
Estructura y evolución de RdRp en virus de ARN y sus superfamilias.
Hay 4 superfamilias de virus que cubren todos los virus que contienen ARN sin etapa de ADN:
Virus que contienen ARN de cadena positiva o ARN de doble cadena, excepto retrovirus y Birnaviridae
Todos los virus eucariotas de ARN de cadena positiva sin etapa de ADN
Los flavivirus producen una poliproteína del genoma de ssRNA. La poliproteína se escinde en varios productos, uno de los cuales es NS5, una ARN polimerasa dependiente de ARN. Esta ARN polimerasa dirigida por ARN posee varias regiones cortas y motivos homólogos a otras ARN polimerasas dirigidas por ARN. [22]
La ARN replicasa que se encuentra en los virus ssRNA de cadena positiva está relacionada entre sí, formando tres grandes superfamilias. [23] La ARN replicasa birnaviral es única porque carece del motivo C (GDD) en la palma. [24] El mononegaviral RdRp (PDB 5A22) se ha clasificado automáticamente como similar a (+)-ssRNA RdRps, específicamente uno de Pestivirus y otro de Leviviridae . [25] El monómero Bunyaviral RdRp (PDB 5AMQ) se parece al complejo heterotrimérico del ortomixoviral (Influenza; PDB 4WSB) RdRp. [26]
Dado que es una proteína universal para los virus que contienen ARN, RdRp es un marcador útil para comprender su evolución. [27] Se ha revisado la evolución estructural general de los RdRps virales. [28]
Recombinación
Al replicar su genoma (+)ssRNA , el poliovirus RdRp es capaz de realizar recombinación . La recombinación parece ocurrir mediante un mecanismo de elección de copia en el que RdRp cambia las plantillas de ARNss (+) durante la síntesis de la cadena negativa. [29] La frecuencia de recombinación está determinada en parte por la fidelidad de la replicación de RdRp. [30] Las variantes de RdRp con alta fidelidad de replicación muestran una recombinación reducida, y las RdRp de baja fidelidad exhiben una mayor recombinación. [30] La recombinación mediante el cambio de cadena RdRp también ocurre con frecuencia durante la replicación en los carmovirus y tombusvirus de plantas de ARN monocatenario (+) . [31]
Complementación intragénica
El virus Sendai (familia Paramyxoviridae ) tiene un genoma de ARN lineal, monocatenario, de sentido negativo y no segmentado. La RdRp viral consta de dos subunidades codificadas por el virus, una P más pequeña y una L más grande. Cuando se probaron diferentes mutantes de RdRp inactivos con defectos a lo largo de la subunidad L en combinaciones por pares, se observó la restauración de la síntesis de ARN viral en algunos combinaciones. [32] Esta interacción L-L positiva se conoce como complementación intragénica e indica que la proteína L es un oligómero en el complejo viral de ARN polimerasa. [ cita necesaria ]
Terapias con medicamentos
Los RdRps se pueden utilizar como objetivos farmacológicos para patógenos virales, ya que su función no es necesaria para la supervivencia de los eucariotas. Al inhibir la función de la ARN polimerasa dependiente de ARN, no se pueden replicar nuevos ARN a partir de una cadena molde de ARN; sin embargo, la ARN polimerasa dependiente de ADN seguirá siendo funcional.
Actualmente existen medicamentos antivirales contra la hepatitis C y la COVID-19 que se dirigen específicamente a RdRp. Estos incluyen Sofosbuvir y Ribavirina contra la hepatitis C [33] y Remdesivir , el único fármaco aprobado por la FDA contra el COVID-19.
El trifosfato GS-441524 es un sustrato para RdRp, pero no para polimerasas de mamíferos. Da como resultado la terminación prematura de la cadena y la inhibición de la replicación viral. El trifosfato GS-441524 es la forma biológicamente activa del profármaco fosfato Remdesivir . Remdesivir está clasificado como un análogo de nucleótido en el que actúa para inhibir la función de RdRp uniéndose covalentemente e interrumpiendo la terminación del ARN naciente mediante una terminación temprana o tardía o evitando un mayor alargamiento del polinucleótido de ARN. [34] [35] Esta terminación temprana conduce a un ARN no funcional que se degradará mediante procesos celulares normales.
interferencia de ARN
El uso de ARN polimerasa dependiente de ARN desempeña un papel importante en la interferencia del ARN en eucariotas, un proceso utilizado para silenciar la expresión genética mediante la unión de pequeños ARN de interferencia ( ARNip ) al ARNm, dejándolos inactivos. [36] La RdRp eucariota se vuelve activa en presencia de ARNbc y tiene una distribución menos amplia en comparación con otros componentes de ARNi, ya que se perdió en algunos animales, aunque todavía se encuentra en C. elegans y P. tetraurelia [37] y en plantas . [38] Esta presencia de ARNbc desencadena la activación de los procesos RdRp y ARNi al preparar el inicio de la transcripción del ARN mediante la introducción de ARNip en el sistema. [37] En C. elegans , los ARNip se integran en el complejo silenciador inducido por ARN, RISC , que funciona junto con los ARNm destinados a la interferencia para reclutar más RdRps para sintetizar más ARNip secundarios y reprimir la expresión génica. [39]
^ Consulte el clan Pfam para conocer otras familias (+)ssRNA/dsRNA.
^ Una (-) polimerasa de ARNss.
Referencias
^ Koonin EV, Gorbalenya AE, Chumakov KM (julio de 1989). "Identificación provisional de ARN polimerasas dependientes de ARN de virus dsRNA y su relación con las ARN polimerasas virales de cadena positiva". Cartas FEBS . 252 (1–2): 42–46. doi :10.1016/0014-5793(89)80886-5. PMID 2759231. S2CID 36482110.
^ Zanotto PM, Gibbs MJ, Gould EA, Holmes EC (septiembre de 1996). "Una reevaluación de la taxonomía superior de virus basada en ARN polimerasas". Revista de Virología . 70 (9): 6083–6096. doi :10.1128/JVI.70.9.6083-6096.1996. PMC 190630 . PMID 8709232.
^ Baltimore D, Franklin RM (octubre de 1963). "Una nueva polimerasa de ácido ribonucleico que aparece después de la infección de células L por mengovirus". La Revista de Química Biológica . 238 (10): 3395–3400. doi : 10.1016/S0021-9258(18)48679-6 . PMID 14085393.
^ Suttle CA (septiembre de 2005). "Virus en el mar". Naturaleza . 437 (7057): 356–361. Código Bib :2005Natur.437..356S. doi : 10.1038/naturaleza04160. PMID 16163346. S2CID 4370363.
^ Weiner AM (enero de 1988). "Telomeros nucleares eucarióticos: ¿fósiles moleculares del mundo RNP?". Celúla . 52 (2): 155-158. doi :10.1016/0092-8674(88)90501-6. PMID 2449282. S2CID 11491076.
^ Dawkins R (1996). El relojero ciego (PDF) (3d ed.). Londres: WW Norton&Company. pag. 129.ISBN978-0-393-35309-9.
^ Timm C, Gupta A, Yin J (agosto de 2015). "Cinética robusta de un virus de ARN: las tasas de transcripción están determinadas por los niveles del genoma". Biotecnología y Bioingeniería . 112 (8): 1655-1662. doi : 10.1002/bit.25578. PMC 5653219 . PMID 25726926.
^ ab Iyer LM, Koonin EV, Aravind L (enero de 2003). "Conexión evolutiva entre las subunidades catalíticas de las ARN polimerasas dependientes de ADN y las ARN polimerasas dependientes de ARN eucarióticas y el origen de las ARN polimerasas". Biología estructural BMC . 3 : 1. doi : 10.1186/1472-6807-3-1 . PMC 151600 . PMID 12553882.
^ Tan FL, Yin JQ (diciembre de 2004). "RNAi, una nueva estrategia terapéutica contra la infección viral". Investigación celular . 14 (6): 460–466. doi :10.1038/sj.cr.7290248. PMC 7092015 . PMID 15625012.
^ Zong J, Yao X, Yin J, Zhang D, Ma H (noviembre de 2009). "Evolución de los genes de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP): duplicaciones y posibles pérdidas antes y después de la divergencia de los principales grupos eucariotas". Gen. 447 (1): 29–39. doi :10.1016/j.gene.2009.07.004. PMID 19616606.
^ abc Wu J, Gong P (enero de 2018). "Visualización del ciclo de adición de nucleótidos de la ARN polimerasa dependiente de ARN viral". Virus . 10 (1): 24. doi : 10.3390/v10010024 . PMC 5795437 . PMID 29300357.
^ ab Shu B, Gong P (julio de 2016). "Base estructural de la translocación y catálisis de la ARN polimerasa dependiente de ARN viral". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 113 (28): E4005–E4014. Código Bib : 2016PNAS..113E4005S. doi : 10.1073/pnas.1602591113 . PMC 4948327 . PMID 27339134.
^ abcd Venkataraman S, Prasad BV, Selvarajan R (febrero de 2018). "ARN polimerasas dependientes de ARN: conocimientos de estructura, función y evolución". Virus . 10 (2): 76. doi : 10.3390/v10020076 . PMC 5850383 . PMID 29439438.
^ Adkins S, Stawicki SS, Faurote G, Siegel RW, Kao CC (abril de 1998). "El análisis mecanicista de la síntesis de ARN mediante la ARN polimerasa dependiente de ARN de dos promotores revela similitudes con la ARN polimerasa dependiente de ADN". ARN . 4 (4): 455–470. PMC 1369631 . PMID 9630251.
^ Fitzsimmons WJ, Woods RJ, McCrone JT, Woodman A, Arnold JJ, Yennawar M, et al. (junio de 2018). "Una compensación entre velocidad y fidelidad determina la tasa de mutación y la virulencia de un virus de ARN". Más biología . 16 (6): e2006459. doi : 10.1371/journal.pbio.2006459 . PMC 6040757 . PMID 29953453.
^ Hansen JL, Long AM, Schultz SC (agosto de 1997). "Estructura de la ARN polimerasa del poliovirus dependiente de ARN". Estructura . 5 (8): 1109-1122. doi : 10.1016/S0969-2126(97)00261-X . PMID 9309225.
^ Gohara DW, Crotty S, Arnold JJ, Yoder JD, Andino R, Cameron CE (agosto de 2000). "ARN polimerasa dependiente de ARN del poliovirus (3Dpol): análisis estructural, bioquímico y biológico de los motivos estructurales conservados A y B". La Revista de Química Biológica . 275 (33): 25523–25532. doi : 10.1074/jbc.M002671200 . PMID 10827187.
^ O'Reilly EK, Kao CC (diciembre de 1998). "Análisis de la estructura y función de la ARN polimerasa dependiente de ARN guiado por estructuras de polimerasa conocidas y predicciones por computadora de la estructura secundaria". Virología . 252 (2): 287–303. doi : 10.1006/viro.1998.9463 . PMID 9878607.
^ Sauguet L (septiembre de 2019). "La superfamilia extendida de polimerasas de" dos barriles ": estructura, función y evolución". Revista de biología molecular . 431 (20): 4167–4183. doi : 10.1016/j.jmb.2019.05.017 . PMID 31103775.
^ Werner F, Grohmann D (febrero de 2011). "Evolución de las ARN polimerasas multisubunitarias en los tres dominios de la vida". Reseñas de la naturaleza. Microbiología . 9 (2): 85–98. doi :10.1038/nrmicro2507. PMID 21233849. S2CID 30004345.
^ Forrest D, James K, Yuzenkova Y, Zenkin N (junio de 2017). "ARN polimerasa dependiente de ADN de un solo péptido homóloga a la ARN polimerasa de múltiples subunidades". Comunicaciones de la naturaleza . 8 : 15774. Código Bib : 2017NatCo...815774F. doi :10.1038/ncomms15774. PMC 5467207 . PMID 28585540.
^ Tan BH, Fu J, Sugrue RJ, Yap EH, Chan YC, Tan YH (febrero de 1996). "La proteína NS5 del virus del dengue tipo 1 recombinante expresada en Escherichia coli exhibe actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN". Virología . 216 (2): 317–325. doi : 10.1006/viro.1996.0067 . PMID 8607261.
^ Koonin EV (septiembre de 1991). "La filogenia de las ARN polimerasas dependientes de ARN de virus de ARN de cadena positiva". La Revista de Virología General . 72 (Parte 9) (9): 2197–2206. doi : 10.1099/0022-1317-72-9-2197 . PMID 1895057.
^ Shwed PS, Dobos P, Cameron LA, Vakharia VN, Duncan R (mayo de 2002). "Las proteínas VP1 de Birnavirus forman un subgrupo distinto de ARN polimerasas dependientes de ARN que carecen de un motivo GDD". Virología . 296 (2): 241–250. doi : 10.1006/viro.2001.1334 . PMID 12069523.
^ Similitudes estructurales para las entidades en PDB 5A22.
^ Gerlach P, Malet H, Cusack S, Reguera J (junio de 2015). "Conocimientos estructurales sobre la replicación del bunyavirus y su regulación por parte del promotor del vRNA". Celúla . 161 (6): 1267-1279. doi :10.1016/j.cell.2015.05.006. PMC 4459711 . PMID 26004069.
^ Wolf YI, Kazlauskas D, Iranzo J, Lucía-Sanz A, Kuhn JH, Krupovic M, et al. (noviembre de 2018). "Orígenes y evolución del viroma de ARN global". mBio . 9 (6). doi :10.1128/mBio.02329-18. PMC 6282212 . PMID 30482837.
^ Černý J, Černá Bolfíková B, Valdés JJ, Grubhoffer L, Růžek D (2014). "Evolución de la estructura terciaria de las polimerasas dependientes de ARN viral". MÁS UNO . 9 (5): e96070. Código Bib : 2014PLoSO...996070C. doi : 10.1371/journal.pone.0096070 . PMC 4015915 . PMID 24816789.
^ Kirkegaard K, Baltimore D (noviembre de 1986). "El mecanismo de recombinación del ARN en poliovirus". Celúla . 47 (3): 433–443. doi :10.1016/0092-8674(86)90600-8. PMC 7133339 . PMID 3021340.
^ ab Woodman A, Arnold JJ, Cameron CE, Evans DJ (agosto de 2016). "Análisis bioquímico y genético del papel de la polimerasa viral en la recombinación de enterovirus". Investigación de ácidos nucleicos . 44 (14): 6883–6895. doi :10.1093/nar/gkw567. PMC 5001610 . PMID 27317698.
^ Cheng CP, Nagy PD (noviembre de 2003). "Mecanismo de recombinación de ARN en virus carmo y tombus: evidencia de cambio de plantilla mediante la ARN polimerasa dependiente de ARN in vitro". Revista de Virología . 77 (22): 12033–12047. doi :10.1128/jvi.77.22.12033-12047.2003. PMC 254248 . PMID 14581540.
^ Smallwood S, Cevik B, Moyer SA (diciembre de 2002). "Complementación intragénica y oligomerización de la subunidad L de la ARN polimerasa del virus sendai". Virología . 304 (2): 235–245. doi : 10.1006/viro.2002.1720 . PMID 12504565.
^ Waheed Y, Bhatti A, Ashraf M (marzo de 2013). "ARN polimerasa dependiente de ARN del VHC: un objetivo potencial para el desarrollo de fármacos antivirales". Infección, genética y evolución . 14 : 247–257. doi :10.1016/j.meegid.2012.12.004. PMID 23291407.
^ Yin W, Mao C, Luan X, Shen DD, Shen Q, Su H, et al. (junio de 2020). "Base estructural para la inhibición de la ARN polimerasa dependiente de ARN del SARS-CoV-2 por remdesivir". Ciencia . 368 (6498): 1499-1504. Código Bib : 2020 Ciencia... 368.1499Y. doi : 10.1126/ciencia.abc1560. PMC 7199908 . PMID 32358203.
^ Malin JJ, Suárez I, Priesner V, Fätkenheuer G, Rybniker J (diciembre de 2020). "Remdesivir contra COVID-19 y otras enfermedades virales". Reseñas de microbiología clínica . 34 (1). doi :10.1128/CMR.00162-20. PMC 7566896 . PMID 33055231.
^ Simaan JA, Aviado DM (noviembre de 1975). "Efectos hemodinámicos de los propulsores de aerosoles. II. Circulación pulmonar en el perro". Toxicología . 5 (2): 139–146. doi :10.1016/0300-483x(75)90110-9. PMID 1873.
^ ab Marker S, Le Mouël A, Meyer E, Simon M (julio de 2010). "Se requieren ARN polimerasas dependientes de ARN distintas para el ARNi desencadenado por ARN bicatenario frente a transgenes truncados en Paramecium tetraurelia". Investigación de ácidos nucleicos . 38 (12): 4092–4107. doi : 10.1093/nar/gkq131. PMC 2896523 . PMID 20200046.
^ Willmann MR, Endres MW, Cook RT, Gregory BD (julio de 2011). "Las funciones de las ARN polimerasas dependientes de ARN en Arabidopsis". El libro de Arabidopsis . 9 : e0146. doi :10.1199/tab.0146. PMC 3268507 . PMID 22303271.
^ Zhang C, Ruvkun G (agosto de 2012). "Nuevos conocimientos sobre la amplificación de ARNip y ARNi". Biología del ARN . 9 (8): 1045–1049. doi :10.4161/rna.21246. PMC 3551858 . PMID 22858672.
