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Helicasa

Estructura de la helicasa RuvA de E. coli (nótese que el núcleo de la helicasa en el complejo RuvAB es RuvB y no RuvA y que RuvA por sí sola no muestra actividad de helicasa)

Las helicasas son una clase de enzimas que se cree que son vitales para todos los organismos . Su función principal es descomprimir el material genético de un organismo . Las helicasas son proteínas motoras que se mueven direccionalmente a lo largo de una cadena principal de ácido nucleico fosfodiéster , separando dos cadenas de ácido nucleico hibridadas (de ahí el nombre de helic- + -asa ), utilizando energía de la hidrólisis de ATP . Hay muchas helicasas, que representan la gran variedad de procesos en los que debe catalizarse la separación de cadenas. Aproximadamente el 1% de los genes eucariotas codifican helicasas. [1]

El genoma humano codifica 95 helicasas no redundantes: 64 helicasas de ARN y 31 helicasas de ADN. [2] Muchos procesos celulares, como la replicación del ADN , la transcripción , la traducción , la recombinación , la reparación del ADN y la biogénesis de los ribosomas, implican la separación de las cadenas de ácidos nucleicos que requieren el uso de helicasas. Algunas helicasas especializadas también participan en la detección de ácidos nucleicos virales durante la infección y cumplen una función inmunológica. Una helicasa es una enzima que desempeña un papel crucial en los procesos de replicación y reparación del ADN. Su función principal es desenrollar la molécula de ADN bicatenario rompiendo los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases complementarios, lo que permite que las cadenas de ADN se separen. Esto crea una horquilla de replicación, que sirve como plantilla para sintetizar nuevas cadenas de ADN. La helicasa es un componente esencial de los mecanismos celulares que garantiza la replicación precisa del ADN y el mantenimiento de la información genética. La helicasa del ADN cataliza la regresión. RecG y la enzima PriA trabajan juntas para rebobinar el ADN dúplex, creando una unión Holliday. RecG libera las proteínas unidas y la helicasa PriA facilita la recarga del ADN para reanudar la replicación del ADN. RecG reemplaza a la proteína de unión de cadena sencilla (SSB), que regula los sitios de carga de la horquilla de la helicasa durante la regresión de la horquilla. La proteína SSB interactúa con las helicasas de ADN PriA y RecG para recuperar las horquillas de replicación de ADN estancadas. Estas enzimas deben unirse a la helicasa SSB para cargarse en las horquillas estancadas. El deslizamiento térmico y la unión del dúplex de ADN posiblemente estén respaldados por el dominio de cuña de la asociación de RecG con el enlazador SSB. En una reacción de regresión facilitada por RecG y ATP, se crean uniones Holliday para su posterior procesamiento.

Función

Las helicasas se utilizan a menudo para separar hebras de una doble hélice de ADN o una molécula de ARN autoanclada utilizando la energía de la hidrólisis de ATP , un proceso caracterizado por la ruptura de enlaces de hidrógeno entre bases de nucleótidos ancladas . También funcionan para eliminar proteínas asociadas a ácidos nucleicos y catalizar la recombinación de ADN homólogo . [3] Los procesos metabólicos del ARN, como la traducción, la transcripción, la biogénesis de ribosomas , el empalme de ARN , el transporte de ARN, la edición de ARN y la degradación de ARN, son todos facilitados por las helicasas. [3] Las helicasas se mueven de forma incremental a lo largo de una hebra de ácido nucleico del dúplex con una direccionalidad y procesividad específicas para cada enzima en particular.

Las helicasas adoptan diferentes estructuras y estados de oligomerización . Mientras que las helicasas similares a DnaB desenrollan el ADN como hexámeros en forma de anillo , se ha demostrado que otras enzimas son activas como monómeros o dímeros . Los estudios han demostrado que las helicasas pueden actuar pasivamente, esperando que se produzca el desenrollado no catalizado y luego translocándose entre cadenas desplazadas, [4] o pueden desempeñar un papel activo en la catálisis de la separación de cadenas utilizando la energía generada en la hidrólisis de ATP. [5] En el último caso, la helicasa actúa de manera comparable a un motor activo, desenrollándose y translocándose a lo largo de su sustrato como resultado directo de su actividad ATPasa. [6] Las helicasas pueden procesar mucho más rápido in vivo que in vitro debido a la presencia de proteínas accesorias que ayudan en la desestabilización de la unión en horquilla. [6]

La helicasa (triángulo azul) separa las cadenas de ADN entrelazadas para que se puedan formar cadenas hijas.
La helicasa (triángulo azul) separa las cadenas de ADN entrelazadas para que se puedan formar cadenas hijas .

Barrera de activación en la actividad de la helicasa

La acción de la helicasa enzimática, como el desenrollado de los ácidos nucleicos, se logra mediante la reducción de la barrera de activación ( ) de cada acción específica. [7] [5] [8] [9] La barrera de activación es el resultado de varios factores y se puede definir por

dónde

Los factores que contribuyen a la altura de la barrera de activación incluyen: la secuencia de ácido nucleico específica de la molécula involucrada, el número de pares de bases involucrados, la tensión presente en la horquilla de replicación y las fuerzas de desestabilización. [7] [5] [8] [9]

Helicasas activas y pasivas

El tamaño de la barrera de activación a superar por la helicasa contribuye a su clasificación como una helicasa activa o pasiva. En las helicasas pasivas, existe una barrera de activación significativa (definida como , donde es la constante de Boltzmann y es la temperatura del sistema). Debido a esta barrera de activación significativa, su progresión de desenrollado se ve afectada en gran medida por la secuencia de ácidos nucleicos dentro de la molécula a desenrollar y la presencia de fuerzas de desestabilización que actúan sobre la horquilla de replicación. [7] [5] [8] [9] Ciertas combinaciones de ácidos nucleicos disminuirán las tasas de desenrollado (es decir, guanina y citosina ), mientras que varias fuerzas desestabilizadoras pueden aumentar la tasa de desenrollado. [5] [8] [9] En sistemas pasivos, la tasa de desenrollado ( ) es menor que la tasa de translocación ( ) (translocación a lo largo del ácido nucleico monocatenario, ssNA), debido a su dependencia del desenrollado transitorio de los pares de bases en la horquilla de replicación para determinar su tasa de desenrollado. [7] [5] [8] [9]

En las helicasas activas, , donde el sistema carece de una barrera significativa, ya que la helicasa puede desestabilizar los ácidos nucleicos, desenrollando la doble hélice a una velocidad constante, independientemente de la secuencia de ácidos nucleicos. En las helicasas activas, está más cerca de , debido a la capacidad de la helicasa activa de desestabilizar directamente la horquilla de replicación para promover el desenrollado. [7] [5] [8] [9]

Las helicasas activas muestran un comportamiento similar cuando actúan sobre ácidos nucleicos de doble cadena, dsNA o ssNA, en lo que respecta a las tasas de desenrollado y las tasas de translocación, donde en ambos sistemas y son aproximadamente iguales.

Estas dos categorías de helicasas también pueden modelarse como mecanismos. En tales modelos, las helicasas pasivas se conceptualizan como trinquetes brownianos, impulsados ​​por fluctuaciones térmicas y gradientes anisotrópicos subsiguientes a través de la red de ADN. Las helicasas activas, en cambio, se conceptualizan como motores paso a paso, también conocidos como motores de carrera de potencia, que utilizan un mecanismo de "gusano de pulgada" conformacional o un mecanismo de "caminar" mano sobre mano para progresar. [10] Dependiendo del organismo, dicho progreso de travesía de hélice puede ocurrir a velocidades de rotación en el rango de 5000 [11] a 10 000 [12] RPM.

Historia de las helicasas de ADN

Las helicasas de ADN se descubrieron en E. coli en 1976. Esta helicasa se describió como una "enzima desenrolladora de ADN" que "desnaturaliza los dúplex de ADN en una reacción dependiente de ATP, sin degradarse de manera detectable". [13] La primera helicasa de ADN eucariota descubierta fue en 1978 en la planta de lirio. [14] Desde entonces, se descubrieron y aislaron helicasas de ADN en otras bacterias, virus, levaduras, moscas y eucariotas superiores. [15] Hasta la fecha, se han aislado al menos 14 helicasas diferentes de organismos unicelulares, 6 helicasas de bacteriófagos, 12 de virus, 15 de levaduras, 8 de plantas, 11 de timo de ternera y aproximadamente 25 helicasas de células humanas. [16] A continuación se presenta una historia del descubrimiento de helicasas:

Características estructurales

La función común de las helicasas explica el hecho de que muestren un cierto grado de homología en la secuencia de aminoácidos ; todas poseen motivos de secuencia ubicados en el interior de su estructura primaria , involucrados en la unión de ATP , la hidrólisis de ATP y la translocación a lo largo del sustrato de ácido nucleico . La porción variable de la secuencia de aminoácidos está relacionada con las características específicas de cada helicasa.

La presencia de estos motivos de helicasa permite atribuir una supuesta actividad de helicasa a una proteína determinada, pero no necesariamente confirma que se trata de una helicasa activa. Sin embargo, los motivos conservados sí respaldan una homología evolutiva entre enzimas. Basándose en estos motivos de helicasa, se han distinguido varias superfamilias de helicasas.

Superfamilias

Las helicasas se clasifican en 6 grupos (superfamilias) según sus motivos de secuencia compartidos. [26] Las helicasas que no forman una estructura de anillo se encuentran en las superfamilias 1 y 2, y las helicasas que forman anillos forman parte de las superfamilias 3 a 6. [27] Las helicasas también se clasifican como α o β dependiendo de si funcionan con ADN de cadena simple o doble; las helicasas α funcionan con ADN de cadena simple y las helicasas β funcionan con ADN de cadena doble . También se clasifican por polaridad de translocación. Si la translocación ocurre 3'-5' la helicasa es de tipo A; si la translocación ocurre 5'-3' es de tipo B. [26]

Todas las helicasas son miembros de una familia que contiene un bucle P o un motivo Walker .

Trastornos y enfermedades de la helicasa

Mutaciones de la helicasa ATRX

El gen ATRX codifica la helicasa dependiente de ATP, ATRX (también conocida como XH2 y XNP) de la familia del subgrupo SNF2, que se cree que es responsable de funciones como la remodelación de la cromatina, la regulación genética y la metilación del ADN. [31] [32] [33] [34] Estas funciones ayudan a prevenir la apoptosis, lo que resulta en la regulación del tamaño cortical, así como una contribución a la supervivencia de las estructuras hipocampales y corticales, afectando la memoria y el aprendizaje. [31] Esta helicasa se encuentra en el cromosoma X (Xq13.1-q21.1), en la heterocromatina pericentromérica y se une a la proteína heterocromatina 1. [ 31] [33] Los estudios han demostrado que ATRX desempeña un papel en la metilación del ADNr y es esencial para el desarrollo embrionario. [35] Se han encontrado mutaciones en toda la proteína ATRX , y más del 90% de ellas se encuentran en los dominios de dedo de zinc y helicasa. [36] Las mutaciones de ATRX pueden provocar retraso mental asociado a talasemia alfa ligada al cromosoma X ( síndrome ATR-X ). [31]

Se ha descubierto que varios tipos de mutaciones encontradas en ATRX están asociadas con ATR-X, incluidas las mutaciones más comunes de una sola base sin sentido, así como las mutaciones sin sentido, de cambio de marco y de deleción. [34] Las características de ATR-X incluyen: microcefalia, anomalías esqueléticas y faciales, retraso mental, anomalías genitales, convulsiones, uso y capacidad limitados del lenguaje y alfa-talasemia. [31] [35] [32] El fenotipo observado en ATR-X sugiere que la mutación del gen ATRX causa la regulación negativa de la expresión genética, como los genes de alfa-globina. [32] Todavía se desconoce qué causa la expresión de las diversas características de ATR-X en diferentes pacientes. [35]

Mutaciones puntuales de la helicasa XPD

XPD (factor D del xeroderma pigmentoso, también conocido como proteína ERCC2) es una helicasa dependiente de ATP de la superfamilia II, de 5'-3', que contiene dominios de grupos de hierro-azufre. [26] [37] Se ha demostrado que las mutaciones puntuales heredadas en la helicasa XPD están asociadas con trastornos de envejecimiento acelerado como el síndrome de Cockayne (SC) y la tricotiodistrofia (TTD). [38] El síndrome de Cockayne y la tricotiodistrofia son trastornos del desarrollo que implican sensibilidad a la luz ultravioleta y envejecimiento prematuro, y el síndrome de Cockayne presenta retraso mental grave desde el momento del nacimiento. [38] La mutación de la helicasa XPD también se ha relacionado con el xeroderma pigmentoso (XP), un trastorno caracterizado por la sensibilidad a la luz ultravioleta y que resulta en un aumento de varios miles de veces en el desarrollo de cáncer de piel. [38]

XPD es un componente esencial del complejo TFIIH , un factor de transcripción y reparación en la célula. [38] [39] [40] [41] [42] Como parte de este complejo, facilita la reparación por escisión de nucleótidos desenrollando el ADN. [38] TFIIH ayuda a reparar el ADN dañado, como el daño solar. [38] [39] [40] [41] [42] Una mutación en la helicasa XPD que ayuda a formar este complejo y contribuye a su función causa la sensibilidad a la luz solar observada en las tres enfermedades, así como el mayor riesgo de cáncer observado en XP y el envejecimiento prematuro observado en la tricotiodistrofia y el síndrome de Cockayne. [38]

Las mutaciones de la helicasa XPD que conducen a la tricotiodistrofia se encuentran en toda la proteína en varias ubicaciones involucradas en las interacciones proteína-proteína. [38] Esta mutación da como resultado una proteína inestable debido a su incapacidad para formar interacciones estabilizadoras con otras proteínas en los puntos de mutación. [38] Esto, a su vez, desestabiliza todo el complejo TFIIH, lo que conduce a defectos en los mecanismos de transcripción y reparación de la célula. [38]

Se ha sugerido que las mutaciones de la helicasa XPD que conducen al síndrome de Cockayne podrían ser el resultado de mutaciones dentro de XPD, que causan rigidez de la proteína y la posterior incapacidad de cambiar de funciones de reparación a funciones de transcripción debido a un "bloqueo" en el modo de reparación. [38] Esto podría hacer que la helicasa corte segmentos de ADN destinados a la transcripción. [38] Aunque la evidencia actual apunta a un defecto en la helicasa XPD que resulta en una pérdida de flexibilidad en la proteína en casos de síndrome de Cockayne, aún no está claro cómo esta estructura de proteína conduce a los síntomas descritos en el síndrome de Cockayne. [38]

En el xeroderma pigmentosa, la mutación de la helicasa XPD existe en el sitio de unión del ATP o del ADN. [38] Esto da como resultado una helicasa estructuralmente funcional capaz de facilitar la transcripción, sin embargo inhibe su función en el desenrollado del ADN y la reparación del ADN. [38] La falta de la capacidad de una célula para reparar mutaciones, como las causadas por el daño solar, es la causa de la alta tasa de cáncer en pacientes con xeroderma pigmentosa.

Mutaciones de la familia RecQ

Helicasa RecQ

Las helicasas RecQ (3'-5') pertenecen al grupo de helicasas de la Superfamilia II, que ayudan a mantener la estabilidad del genoma y suprimen la recombinación inapropiada. [43] [44] Las deficiencias y/o mutaciones en las helicasas de la familia RecQ muestran una recombinación genética aberrante y/o replicación de ADN, lo que conduce a la inestabilidad cromosómica y una disminución general de la capacidad de proliferación. [43] Se ha demostrado que las mutaciones en las helicasas de la familia RecQ BLM, RECQL4 y WRN, que desempeñan un papel en la regulación de la recombinación homóloga, dan lugar a las enfermedades autosómicas recesivas síndrome de Bloom (BS), síndrome de Rothmund-Thomson (RTS) y síndrome de Werner (WS), respectivamente. [44] [45]

El síndrome de Bloom se caracteriza por una predisposición al cáncer de aparición temprana, con una edad media de aparición de 24 años. [44] [46] Las células de los pacientes con síndrome de Bloom muestran una alta frecuencia de intercambio recíproco entre cromátidas hermanas (SCE) y daño cromosómico excesivo. [47] Hay evidencia que sugiere que BLM desempeña un papel en el rescate de la replicación de ADN interrumpida en las horquillas de replicación. [47]

El síndrome de Werner es un trastorno de envejecimiento prematuro, con síntomas que incluyen la aparición temprana de aterosclerosis y osteoporosis y otras enfermedades relacionadas con la edad, una alta incidencia de sarcoma y muerte que a menudo ocurre por infarto de miocardio o cáncer en la cuarta a sexta década de la vida. [44] [48] Las células de los pacientes con síndrome de Werner exhiben una vida reproductiva reducida con roturas y translocaciones cromosómicas, así como grandes deleciones de componentes cromosómicos, lo que causa inestabilidad genómica. [48]

El síndrome de Rothmund-Thomson, también conocido como poiquilodermia congénita , se caracteriza por envejecimiento prematuro, anomalías cutáneas y esqueléticas, erupción cutánea, poiquilodermia , cataratas juveniles y predisposición a cánceres como osteosarcomas. [44] [49] En las células de los pacientes con síndrome de Rothmund-Thomson se encuentran reordenamientos cromosómicos que causan inestabilidad genómica. RecQ es una familia de enzimas helicasas de ADN que se encuentran en varios organismos, incluidas bacterias, arqueas y eucariotas (como los humanos). Estas enzimas desempeñan papeles importantes en el metabolismo del ADN durante la replicación, recombinación y reparación del ADN. Hay cinco proteínas helicasas RecQ conocidas en humanos: RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 y RecQ5. Las mutaciones en algunos de estos genes están asociadas con trastornos genéticos. Por ejemplo, las mutaciones en el gen BLM causan el síndrome de Bloom, que se caracteriza por un mayor riesgo de cáncer y otros problemas de salud. [50] Las mutaciones en el gen WRN conducen al síndrome de Werner, una afección caracterizada por el envejecimiento prematuro y un mayor riesgo de enfermedades relacionadas con la edad. Las helicasas RecQ son cruciales para mantener la estabilidad e integridad genómicas. Ayudan a prevenir la acumulación de anomalías genéticas que pueden conducir a enfermedades como el cáncer. La integridad del genoma depende de la familia de helicasas de ADN RecQ, que incluye procesos de reparación, recombinación, replicación y transcripción del ADN. La inestabilidad del genoma y el envejecimiento prematuro son afecciones que surgen de mutaciones en las helicasas RecQ humanas. [51] La helicasa RecQ Sgs1 falta en las células de levadura, lo que las convierte en modelos útiles para comprender las anomalías celulares humanas y la función de la helicasa RecQ. [52] El miembro de la familia de helicasas RecQ, RECQ1, está conectado a una pequeña cantidad de trastornos genéticos de cáncer poco comunes en individuos. Participa en la transcripción, el ciclo celular y la reparación del ADN. Según una investigación reciente, las mutaciones sin sentido en el gen RECQ1 pueden desempeñar un papel en el desarrollo del cáncer de mama familiar. Las helicasas de ADN son frecuentemente atraídas a regiones de ADN dañado y son esenciales para la replicación, recombinación, reparación y transcripción del ADN celular. La manipulación química de sus procesos moleculares puede cambiar la velocidad a la que se dividen las células cancerosas, así como la eficiencia de las transacciones y la homeostasis celular. El atrapamiento inducido por moléculas pequeñas de las helicasas de ADN, un tipo de proteína metabólica del ADN, puede tener consecuencias nocivas para las células cancerosas que proliferan rápidamente, lo que podría ser eficaz en el tratamiento del cáncer.

Durante la meiosis, las roturas de doble cadena de ADN y otros daños en el ADN de una cromátida se reparan mediante recombinación homóloga utilizando la cromátida hermana o una cromátida no hermana homóloga como plantilla. Esta reparación puede dar como resultado un recombinante cruzado (CO) o, más frecuentemente, un recombinante no cruzado (NCO). En la levadura Schizosaccharomyces pombe, la helicasa de ADN FmI1 de la familia FANCM dirige la formación de la recombinación NCO durante la meiosis. [53] La helicasa de tipo RecQ Rqh1 también dirige la recombinación meiótica NCO. [54] Estas helicasas, a través de su capacidad para desenrollar intermediarios del bucle D , promueven la recombinación NCO mediante el proceso de recocido de cadena dependiente de la síntesis .

En la planta Arabidopsis thaliana , la helicasa FANCM promueve la NCO y antagoniza la formación de recombinantes de CO. [55] Otra helicasa, RECQ4A/B, también reduce de forma independiente los CO. Se sugirió que los CO están restringidos debido a los costos a largo plazo de la recombinación de CO, es decir, la ruptura de combinaciones genéticas favorables de alelos construidas por la selección natural pasada . [55]

Helicasas de ARN

Helicasa de ARN de caja muerta humana
A
Esta imagen representa las diferentes secuencias promotoras y los dominios accesorios que ayudan en el desenrollado del ARN (separación local de la cadena). Las regiones en rojo son dominios de unión de ATP y las regiones en amarillo son dominios de interacción del ARN. También están presentes secuencias específicas denominadas proteínas de caja DEAD que ayudan a catalizar reacciones en las que el ATP no necesita ser hidrolizado directamente, siempre que se una a los dominios de la cadena.

Las helicasas de ARN son esenciales para la mayoría de los procesos del metabolismo del ARN, como la biogénesis de los ribosomas , el empalme del pre-ARNm y la iniciación de la traducción . También desempeñan un papel importante en la detección de ARN virales. [56] Las helicasas de ARN están involucradas en la mediación de la respuesta inmune antiviral porque pueden identificar ARN extraños en vertebrados. Aproximadamente el 80% de todos los virus son virus de ARN y contienen sus propias helicasas de ARN. [57] Las helicasas de ARN defectuosas se han relacionado con cánceres, enfermedades infecciosas y trastornos neurodegenerativos. [56] Algunos trastornos neurológicos asociados con helicasas de ARN defectuosas son: esclerosis lateral amiotrófica , atrofia muscular espinal , ataxia espinocerebelosa tipo 2 , enfermedad de Alzheimer y síndrome de contractura congénita letal . [57]

Las helicasas de ARN y las helicasas de ADN se pueden encontrar juntas en todas las superfamilias de helicasas excepto en SF6. [58] [59] Todas las helicasas de ARN eucariotas que se han identificado hasta la fecha no forman anillos y son parte de SF1 y SF2. Por otro lado, se han encontrado helicasas de ARN formadoras de anillos en bacterias y virus. [56] Sin embargo, no todas las helicasas de ARN exhiben actividad helicasa según lo definido por la función enzimática, es decir, proteínas de la familia Swi/Snf. Aunque estas proteínas llevan los motivos helicasa típicos, hidrolizan ATP de una manera dependiente del ácido nucleico y están construidas alrededor de un núcleo de helicasa, en general, no se observa actividad de desenrollado. [60]

Las helicasas de ARN que exhiben actividad de desenrollado se han caracterizado por al menos dos mecanismos diferentes: desenrollado de dúplex canónico y separación local de la cadena. El desenrollado de dúplex canónico es la separación direccional por pasos de una cadena de dúplex, como se describió anteriormente, para el desenrollado de ADN. Sin embargo, la separación local de la cadena ocurre mediante un proceso en el que la enzima helicasa se carga en cualquier lugar a lo largo del dúplex. Esto suele ser ayudado por una región monocatenaria del ARN, y la carga de la enzima está acompañada por la unión de ATP. [61] Una vez que la helicasa y el ATP están unidos, ocurre la separación local de la cadena, que requiere la unión de ATP pero no el proceso real de hidrólisis de ATP. [62] Presentado con menos pares de bases, el dúplex se disocia sin más ayuda de la enzima. Este modo de desenrollado es utilizado por las helicasas de caja DEAD/DEAH . [63]

Actualmente hay disponible en línea una base de datos de helicasas de ARN [64] que contiene una lista completa de helicasas de ARN con información como secuencia, estructura y funciones bioquímicas y celulares. [56]

Herramientas de diagnóstico para la medición de helicasas

Medición y seguimiento de la actividad de la helicasa

Se utilizan varios métodos para medir la actividad de la helicasa in vitro . Estos métodos van desde ensayos cualitativos (ensayos que generalmente implican resultados que no involucran valores o mediciones) hasta cuantitativos (ensayos con resultados numéricos que pueden utilizarse en análisis estadísticos y numéricos). En 1982-1983, se desarrolló el primer ensayo bioquímico directo para medir la actividad de la helicasa. [15] [65] Este método se denominó "ensayo de desplazamiento de cadena".

Posteriormente se desarrollaron otros métodos que incorporaban algunos, si no todos, los siguientes: mecánica de alto rendimiento, el uso de marcaje de nucleótidos no radiactivos, tiempo de reacción más rápido/menor consumo de tiempo, monitoreo en tiempo real de la actividad de la helicasa (usando medición cinética en lugar de análisis de punto final/punto único). Estas metodologías incluyen: "un método de flujo de extinción rápido, ensayos basados ​​en fluorescencia, ensayos de filtración, un ensayo de proximidad de centelleo , un ensayo de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia con resolución temporal , un ensayo basado en tecnología de placa flash, ensayos de extinción de fluorescencia homogéneos con resolución temporal y ensayos de helicasa basados ​​en electroquimioluminiscencia". [16] Con el uso de ecuaciones matemáticas especializadas, algunos de estos ensayos se pueden utilizar para determinar cuántos nucleótidos apareados de bases puede romper una helicasa por hidrólisis de 1 molécula de ATP. [66]

También se encuentran disponibles comercialmente kits de diagnóstico. Uno de estos kits es el ensayo de diagnóstico "Trupoint" de PerkinElmer , Inc. Este ensayo es un ensayo de extinción de fluorescencia con resolución temporal que utiliza la tecnología "SignalClimb" de PerkinElmer, que se basa en dos etiquetas que se unen en estrecha proximidad entre sí, pero en cadenas de ADN opuestas. Una etiqueta es un quelato de lantánido fluorescente, que sirve como etiqueta que se monitorea a través de un lector de placa de 96/384 pocillos adecuado. La otra etiqueta es una molécula extintora orgánica. La base de este ensayo es la "extinción" o represión de la señal del quelato de lantánido por la molécula extintora orgánica cuando los dos están en estrecha proximidad, como lo estarían cuando el dúplex de ADN está en su estado nativo. Tras la actividad de la helicasa en el dúplex, las etiquetas extintora y lantánida se separan a medida que se desenrolla el ADN. Esta pérdida de proximidad anula la capacidad de los inhibidores de reprimir la señal de los lantánidos, lo que provoca un aumento detectable de la fluorescencia que es representativo de la cantidad de ADN desenrollado y puede utilizarse como una medida cuantificable de la actividad de la helicasa. La ejecución y el uso de técnicas de obtención de imágenes de fluorescencia de moléculas individuales, centrándose en métodos que incluyen el atrapamiento óptico junto con la obtención de imágenes epifluorescentes, y también la inmovilización de la superficie junto con la visualización de fluorescencia por reflexión interna total. Combinadas con celdas de flujo de microcanales y control microfluídico, permiten obtener imágenes y realizar un seguimiento de moléculas de ADN y proteínas marcadas con fluorescencia individuales, lo que permite medir el desenrollado y la translocación del ADN con una resolución de una sola molécula. [67]

Determinación de la polaridad de la helicasa

La polaridad de la helicasa, que también se denomina "direccionalidad", se define como la dirección (caracterizada como 5'→3' o 3'→5') del movimiento de la helicasa en la cadena sencilla de ADN/ARN a lo largo de la cual se está moviendo. Esta determinación de la polaridad es vital para, por ejemplo, determinar si la helicasa probada se une a la cadena principal de ADN o a la cadena rezagada de ADN. Para caracterizar esta característica de la helicasa, se utiliza un ADN parcialmente dúplex como sustrato que tiene una región central de ADN monocatenario con diferentes longitudes de regiones dúplex de ADN (una región corta que corre 5'→3' y una región más larga que corre 3'→5') en ambos lados de esta región. [68] Una vez que la helicasa se agrega a esa región central monocatenaria, la polaridad se determina mediante la caracterización en el ADN monocatenario recién formado.

Véase también

Referencias

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