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El ARN antisentido ( ARNsA ), también conocido como transcripción antisentido, [1] transcripción antisentido natural (NAT) [2] [3] [4] u oligonucleótido antisentido , [5] es un ARN monocatenario que es complementario a un ARN mensajero codificador de proteínas (ARNm) con el que se hibrida y, por lo tanto, bloquea su traducción a proteína . Los ARNsA (que se producen de forma natural) se han encontrado tanto en procariotas como en eucariotas , [1] y se pueden clasificar en ARN no codificantes (ARNnc) cortos (<200 nucleótidos) y largos (>200 nucleótidos). [4] La función principal del ARNsA es regular la expresión génica . Los ARNsA también se pueden producir sintéticamente y han encontrado un uso generalizado como herramientas de investigación para la eliminación de genes . También pueden tener aplicaciones terapéuticas. [6] [1] [4]
Algunos de los primeros asRNAs fueron descubiertos mientras se investigaban proteínas funcionales. Un ejemplo fue el asRNA micF . Mientras se caracterizaba la porina de membrana externa ompC en E. coli , algunos de los clones del promotor ompC observados fueron capaces de reprimir la expresión de otra porina de membrana como ompF. Se encontró que la región responsable de esta función de represión era un locus de 300 pares de bases aguas arriba del promotor ompC. Esta región de 300 pares de bases es 70% homóloga en secuencia con el extremo 5' del ARNm ompF y por lo tanto la transcripción de este locus de 300 pares de bases era complementaria al ARNm ompF. Más tarde, se encontró que esta transcripción, denominada micF, era un asRNA de ompF y capaz de regular a la baja la expresión de ompF bajo estrés formando un dúplex con el ARNm ompF. Esto induce la degradación del ARNm ompF. [2]
A diferencia del ARN micF que se descubrió por accidente, la mayoría de los asRNA se descubrieron mediante búsquedas en todo el genoma de pequeños ARN reguladores y mediante análisis del transcriptoma . Convencionalmente, el primer paso implica predicciones computacionales basadas en algunas características conocidas de los asRNA. Durante las búsquedas computacionales, se excluyen las regiones codificantes. Las regiones que se predice que tienen estructuras de ARN conservadas y actúan como promotores huérfanos y terminadores independientes de Rho se prefieren durante el análisis. Debido a que las búsquedas computacionales se centran en la región intergénica , es probable que los asRNA que se transcriben a partir de la cadena opuesta de un gen codificante se pasen por alto utilizando este método. Para detectar asRNA transcrito a partir de la región codificante, se pueden utilizar microarreglos de oligonucleótidos . En este método, una o ambas cadenas de genes codificantes se pueden utilizar como sondas. Además de las búsquedas computacionales y los microarreglos, algunos asRNA se descubrieron mediante la secuenciación de clones de ADNc, así como mediante el mapeo de elementos promotores. [7] Aunque muchos de los hallazgos de los enfoques mencionados anteriormente dieron lugar a una gran cantidad de posibles ARNas, solo unos pocos se demostraron como ARNas reales mediante pruebas funcionales adicionales. Para minimizar la cantidad de resultados falsos positivos, los nuevos enfoques de los últimos años se han centrado en la transcripción específica de la cadena, la unión de la cromatina a ARNs no codificantes y estudios de células individuales. [1]
La idea de los asRNA como dianas farmacológicas surgió en 1978, cuando Zamecnik y Stephenson encontraron un oligonucleótido antisentido para el ARN viral del virus de la escarcoma de Rous que era capaz de inhibir la replicación viral y la síntesis de proteínas. Desde entonces, se ha dedicado mucho esfuerzo al desarrollo de asRNA como candidatos a fármacos. En 1998, la FDA aprobó el primer fármaco asRNA, fomivirsen . Fomivirsen, un oligonucleótido de 21 pares de bases, fue desarrollado para tratar la retinitis por citomegalovirus en pacientes con SIDA. Funciona al dirigirse al ARNm transcrito del virus y, en consecuencia, inhibir la replicación del citomegalovirus. A pesar de que fomivirsen se suspendió en 2004 debido a la pérdida del mercado, sirvió como un ejemplo exitoso e inspirador del uso de asRNA como dianas farmacológicas o candidatos a fármacos. [5]
Otro ejemplo del uso de un ARNm como agente terapéutico es el mipomersen , que fue aprobado por la FDA en 2013. El mipomersen se desarrolló para controlar el nivel de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL) en pacientes con hipercolesterolemia familiar homocigótica (HoFH), que es una afección genética autosómica dominante poco común. Debido al alto nivel de colesterol total (650-1000 mg/dl) y receptor de LDL (por encima de 600 mg/dl) en HoFH, los pacientes con HoFH tienen un alto riesgo de enfermedad cardíaca coronaria. Debido a que se ha descubierto que la proteína apo-B-100 es necesaria para producir lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) y LDL, el mipomersen se complementa con el ARNm de apo-B-100 y lo dirige a la degradación dependiente de la ARNasa H. En última instancia, el mipomersen puede reducir el nivel de LDL. [8]
Los asRNA iniciales descubiertos estaban en procariotas incluyendo plásmidos , bacteriófagos y bacterias . Por ejemplo, en el plásmido ColE1, el asRNA denominado ARN I juega un papel importante en la determinación del número de copias del plásmido controlando la replicación. La replicación de ColE1 depende de la transcripción de un ARN cebador llamado ARN II. Una vez que el ARN II se transcribe, se hibrida con su plantilla de ADN y luego se escinde por la ARNasa H. En presencia del asRNA ARN I, ARN I y ARN II forman un dúplex que introduce un cambio conformacional del ARN II. En consecuencia, el ARN II no puede hibridar con su plantilla de ADN, lo que da como resultado un bajo número de copias de ColE1. En el bacteriófago P22, el asRNA sar ayuda a regular entre el ciclo lítico y lisogénico controlando la expresión de Ant. [9] Además de expresarse en procariotas, los asRNA también se descubrieron en plantas. El ejemplo mejor descrito de regulación de asRNA en plantas es el gen del Locus C de Floración (FLC) . El gen FLC en Arabidopsis thaliana codifica un factor de transcripción que previene la expresión de una variedad de genes que inducen la transición floral. En ambientes fríos, el asRNA del gen FLC, denominado COOLAIR, se expresa e inhibe la expresión de FLC a través de la modificación de la cromatina, lo que en consecuencia permite la floración. [10] Otro ejemplo bien estudiado es el gen DOG1 (Delay of Germination 1). Su nivel de expresión está regulado negativamente por la transcripción antisentido (asDOG1 o 1GOD) que actúa en cis. [11] En células de mamíferos, un ejemplo típico de regulación de asRNA es la inactivación del cromosoma X. Xist , un asRNA, puede reclutar el complejo represor polycomb 2 (PRC2) que da como resultado la heterocromatinización del cromosoma X. [3]
Los ARN antisentido se pueden clasificar de diferentes maneras. En términos de mecanismos reguladores, algunos autores agrupan los ARNas en interacciones ARN-ADN, interacciones ARN-ARN ya sea en el núcleo o en el citoplasma e interacciones ARN-proteína ( epigenéticas ). [3] Los ARN antisentido se pueden categorizar por el tipo de promotores que inician la expresión de los ARNas: promotores independientes, promotores bidireccionales compartidos o promotores crípticos. En términos de longitud, aunque los ARNas en general se clasifican como lncRNAs , hay ARNas cortos con una longitud de menos de 200 pares de bases. Debido a que se ha descubierto que el mecanismo regulador de los ARNas es específico de la especie, los ARNas también se pueden clasificar por especie. [1] Una de las formas comunes de clasificar los ARNas es por dónde se transcriben los ARNas en relación con sus genes diana: actuando en cis y actuando en trans . [ cita requerida ]
Los ARNas que actúan en cis se transcriben a partir de la cadena opuesta del gen diana en el locus del gen diana. A menudo muestran un alto grado o una complementariedad completa con el gen diana. Si el ARNas que actúa en cis regula la expresión génica al dirigirse al ARNm, solo puede dirigirse al ARNm individual. Tras las interacciones con los ARNm de destino, los ARNas que actúan en cis pueden bloquear la unión a los ribosomas o reclutar a la ARNasa para degradar los ARNm de destino. En consecuencia, la función de estos ARNas que actúan en cis es reprimir la traducción de los ARNm de destino. [2] Además de los ARNas que actúan en cis que se dirigen a los ARNm, existen silenciadores y activadores epigenéticos que actúan en cis . Se ha demostrado que el ARN antisentido reprime la traducción del dominio LINE1-ORF2 de Entamoeba histolytica . Sin embargo, aún no se ha confirmado si actúa en cis o en trans. [12]
En términos de modificación epigenética, la acción en cis se refiere a la naturaleza de estos ARNas que regulan los cambios epigenéticos alrededor de los loci donde se transcriben. En lugar de dirigirse a ARNm individuales, estos reguladores epigenéticos que actúan en cis pueden reclutar enzimas modificadoras de la cromatina que pueden ejercer efectos tanto en los loci de transcripción como en los genes vecinos. [3]
Los ARNas que actúan en trans se transcriben a partir de loci que se encuentran distantes de los genes diana. A diferencia de los ARNas que actúan en cis, muestran un bajo grado de complementariedad con el gen diana, pero pueden ser más largos que los ARNas que actúan en cis. También pueden dirigirse a múltiples loci. Debido a estas propiedades de los ARNas que actúan en trans, forman complejos menos estables con sus transcripciones diana y, a veces, requieren la ayuda de proteínas chaperonas de ARN , como Hfq, para ejercer sus funciones. Debido a la complejidad de los ARNas que actúan en trans, actualmente se los considera objetivos menos farmacológicos. [2]
Muchos ejemplos de ARNas muestran el efecto inhibidor sobre la iniciación de la transcripción a través de modificaciones epigenéticas.
La metilación del ADN puede provocar una regulación negativa a largo plazo de genes específicos. Se ha encontrado la represión de proteínas funcionales a través de la metilación del ADN inducida por asRNA en varias enfermedades humanas. En una clase de alfa-talasemia , un tipo de trastorno sanguíneo que tiene un nivel reducido de hemoglobina que conduce a una insuficiencia de oxígeno en los tejidos, [13] el gen de la hemoglobina alfa1 (HBA1) se regula negativamente por una transcripción anormal de la supuesta proteína de unión al ARN similar a Luc7 (LUC71) que actúa como un asRNA para HBA1 e induce la metilación del promotor de HBA1. [1] Otro ejemplo es el silenciamiento de un gen supresor de tumores p15INK4b, también llamado CDKN2B, en la leucemia linfoblástica aguda y la leucemia mieloide aguda. El asRNA que es responsable de este efecto de silenciamiento es el ARN no codificante antisentido en el locus INK ( ANRIL ), que se expresa en el mismo locus que codifica p15INK4b. [3]
En las células eucariotas, el ADN está fuertemente empaquetado por histonas . La modificación de las histonas puede cambiar las interacciones con el ADN, lo que puede inducir cambios en la expresión génica . Las consecuencias biológicas de la metilación de histonas dependen del contexto. En general, la metilación de histonas conduce a la represión génica, pero también se puede lograr la activación génica. [14] La evidencia ha demostrado que la metilación de histonas puede ser inducida por ARNas. Por ejemplo, ANRIL, además de la capacidad de inducir la metilación del ADN, también puede reprimir el gen vecino de CDKN2B , CDKN2A , al reclutar el complejo represor polycomb 2 (PRC2) que conduce a la metilación de histonas (H3K27me). Otro ejemplo clásico es la inactivación del cromosoma X por XIST . [1]
La modificación epigenética inducida por ANRIL es un ejemplo de regulación epigenética que actúa en cis. [3] Además, la modificación de la cromatina inducida por ARN antisentido puede actuar en trans. Por ejemplo, en los mamíferos, el ARN antisentido HOTAIR se transcribe desde el locus homeobox C (HOXC), pero recluta a PRC2 en HOXD, que deposita H3K27 y silencia HOXD. HOTAIR se expresa en gran medida en tumores mamarios primarios. [1]
Las regulaciones epigenéticas como la metilación del ADN y la metilación de histonas pueden reprimir la expresión génica al inhibir el inicio de la transcripción. A veces, sin embargo, la represión génica se puede lograr terminando prematuramente o ralentizando el proceso de transcripción. Los ARNas pueden estar involucrados en este nivel de regulación génica. Por ejemplo, en células bacterianas o eucariotas donde están presentes ARN polimerasas complejas, la transcripción bidireccional en el mismo locus puede conducir a la colisión de la polimerasa y dar como resultado la terminación de la transcripción. Incluso cuando la colisión de la polimerasa es poco probable durante la transcripción débil, también puede ocurrir la pausa de la polimerasa que bloquea la elongación y conduce a la represión génica. Uno de los ejemplos es la represión del gen IME4 por su ARNas RME2. Otra forma de afectar la transcripción cotranscripcionalmente es bloqueando el empalme. Un ejemplo clásico en humanos es el gen homeobox 2 de unión a la caja E de dedo de zinc ( ZEB2 ) que codifica la E-cadherina, un represor transcripcional. La traducción eficiente del ARNm de ZEB2 requiere la presencia de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) en el intrón del ARNm en el extremo 5' . Con la expresión del ARNas de ZEB2, puede enmascarar el sitio de empalme y mantener el IRES en el ARNm, lo que da como resultado una síntesis eficiente de E-cadherina. Por último, dependiendo del nivel de expresión del ARNas, se pueden producir diferentes isoformas de la transcripción sentido. Por lo tanto, la regulación dependiente del ARNas no se limita al mecanismo de encendido/apagado; más bien, presenta un sistema de control de tono fino. [1]
La modulación postranscripcional directa por los ARNas se refiere a que los ARNm son el objetivo de los ARNas directamente; por lo tanto, la traducción se ve afectada. Algunas características de este tipo de ARNas se describen en los ARNas que actúan en cis y en trans. Este mecanismo es relativamente rápido porque tanto el ARNm objetivo como su ARNas deben estar presentes simultáneamente en la misma célula. Como se describe en los ARNas que actúan en cis, el emparejamiento ARNm-ARNas puede resultar en el bloqueo de la entrada al ribosoma y la degradación dependiente de la ARNasa H. En general, los ARNas que se dirigen a los ARNm pueden activar o inhibir la traducción de los ARNm sentido, siendo el efecto inhibidor el más abundante. [1]
Como elemento regulador, los ARNas tienen muchas ventajas para ser considerados como un objetivo farmacológico. En primer lugar, los ARNas regulan la expresión génica en múltiples niveles, incluida la transcripción, la postranscripcion y la modificación epigenética. En segundo lugar, los ARNas que actúan en cis son específicos de la secuencia y muestran un alto grado de complementariedad con los genes diana. [1] En tercer lugar, el nivel de expresión de los ARNas es muy pequeño en comparación con el de los ARNm diana; por lo tanto, solo se requiere una pequeña cantidad de ARNas para producir un efecto. En términos de objetivos farmacológicos, esto representa una gran ventaja porque solo se requiere una dosis baja para la efectividad. [4]
En los últimos años, la idea de dirigir los ARNas para aumentar la expresión génica de una manera específica del locus ha estado atrayendo mucha atención. Debido a la naturaleza del desarrollo de fármacos , siempre es más fácil tener fármacos que funcionen como reguladores a la baja o inhibidores. Sin embargo, existe la necesidad de desarrollar fármacos que puedan activar o regular al alza la expresión génica, como los genes supresores de tumores, los factores de crecimiento neuroprotectores y los genes que se encuentran silenciados en ciertos trastornos mendelianos. Actualmente, el enfoque para restaurar la expresión génica deficiente o la función de la proteína incluye terapias de reemplazo enzimático, terapias de microARN y administración de ADNc funcional. Sin embargo, cada una tiene algunos inconvenientes. Por ejemplo, la proteína sintetizada utilizada en las terapias de reemplazo enzimático a menudo no puede imitar la función completa de la proteína endógena. Además, las terapias de reemplazo enzimático son un compromiso de por vida y conllevan una gran carga financiera para el paciente. Debido a la naturaleza específica del locus de los ARNas y las evidencias de cambios en la expresión del ARNas en muchas enfermedades, ha habido intentos de diseñar oligonucleótidos monocatenarios, conocidos como antagoNAT, para inhibir los ARNas y, en última instancia, aumentar la expresión génica específica. [4]
A pesar de las promesas de los asRNA como dianas farmacológicas o candidatos a fármacos, quedan algunos retos por resolver. [15] En primer lugar, los asRNA y los antagonistas pueden degradarse fácilmente por la ARNasa u otras enzimas degradantes. Para evitar la degradación de los oligonucleótidos terapéuticos, normalmente se requiere una modificación química. La modificación química más común en los oligonucleótidos es añadir un enlace fosforotioato a las cadenas principales. [5] Sin embargo, la modificación del fosforotioato puede ser proinflamatoria. Se han observado efectos adversos que incluyen fiebre, escalofríos o náuseas después de la inyección local de oligonucleótidos modificados con fosforotioato. En segundo lugar, la toxicidad fuera del objetivo también representa un gran problema. A pesar de la naturaleza específica del locus de los asRNA endógenos, solo el 10-50% de los oligonucleótidos sintetizados mostraron el efecto de focalización esperado. Una posible razón para este problema es el alto requerimiento de la estructura de los asRNAs para ser reconocidos por la secuencia objetivo y la ARNasa H. Un solo desajuste puede resultar en una distorsión en la estructura secundaria y conducir a efectos fuera del objetivo. [4] Por último, se ha demostrado que los asRNAs artificiales tienen una absorción intracelular limitada. [5] Aunque se ha demostrado que las neuronas y la glía tienen la capacidad de absorber libremente oligonucleótidos antisentido desnudos, un portador rastreable como virus y vesículas lipídicas aún sería ideal para controlar y monitorear la concentración intracelular y el metabolismo. [4]