La ADN polimerasa I (o Pol I ) es una enzima que participa en el proceso de replicación del ADN procariota . Descubierta por Arthur Kornberg en 1956, [1] fue la primera ADN polimerasa conocida (y la primera conocida de cualquier tipo de polimerasa ). Se caracterizó inicialmente en E. coli y es ubicua en procariotas . En E. coli y muchas otras bacterias, el gen que codifica Pol I se conoce como polA . La enzima Pol I de E. coli está compuesta por 928 aminoácidos y es un ejemplo de una enzima procesiva : puede catalizar secuencialmente múltiples pasos de polimerización sin liberar la plantilla monocatenaria. [2] La función fisiológica de Pol I es principalmente apoyar la reparación del ADN dañado, pero también contribuye a conectar fragmentos de Okazaki eliminando cebadores de ARN y reemplazando los ribonucleótidos con ADN.
En 1956, Arthur Kornberg y sus colegas descubrieron la Pol I utilizando extractos de Escherichia coli ( E. coli ) para desarrollar un ensayo de síntesis de ADN. Los científicos añadieron timidina marcada con 14 C para poder recuperar un polímero radiactivo de ADN, no de ARN. Para iniciar la purificación de la ADN polimerasa, los investigadores añadieron sulfato de estreptomicina al extracto de E. coli . Esto separó el extracto en un sobrenadante libre de ácido nucleico (fracción S) y un precipitado que contenía ácido nucleico (fracción P). La fracción P también contenía Pol I y factores termoestables esenciales para las reacciones de síntesis de ADN. Estos factores se identificaron como trifosfatos de nucleósidos , los componentes básicos de los ácidos nucleicos. La fracción S contenía múltiples desoxinucleósidos quinasas . [3] En 1959, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue otorgado a Arthur Kornberg y Severo Ochoa "por su descubrimiento de los mecanismos implicados en la síntesis biológica del ácido ribonucleico y del ácido desoxirribonucleico ". [4]
La Pol I funciona principalmente en la reparación del ADN dañado. Estructuralmente, la Pol I es un miembro de la superfamilia de proteínas alfa/beta, que abarca proteínas en las que las hélices α y las cadenas β se presentan en secuencias irregulares. La Pol I del ADN de E. coli consta de múltiples dominios con tres actividades enzimáticas distintas. Tres dominios, a menudo denominados dominios del pulgar, del dedo y de la palma, trabajan juntos para mantener la actividad de la ADN polimerasa. [5] Un cuarto dominio junto al dominio de la palma contiene un sitio activo de exonucleasa que elimina los nucleótidos incorporados incorrectamente en una dirección de 3' a 5' en un proceso conocido como corrección de pruebas. Un quinto dominio contiene otro sitio activo de exonucleasa que elimina el ADN o el ARN en una dirección de 5' a 3' y es esencial para la eliminación del cebador del ARN durante la replicación del ADN o del ADN durante los procesos de reparación del ADN.
La bacteria E. coli produce cinco polimerasas de ADN diferentes: ADN Pol I, ADN Pol II, ADN Pol III, ADN Pol IV y ADN Pol V. [6]
En la replicación del ADN, la cadena principal de ADN se extiende continuamente en la dirección del movimiento de la horquilla de replicación, mientras que la cadena rezagada de ADN corre de manera discontinua en la dirección opuesta como los fragmentos de Okazaki . [7] Las ADN polimerasas tampoco pueden iniciar cadenas de ADN, por lo que deben iniciarse mediante segmentos cortos de ARN o ADN conocidos como cebadores. [5] Para que se produzca la polimerización del ADN, se deben cumplir dos requisitos. En primer lugar, todas las ADN polimerasas deben tener una cadena molde y una cadena cebadora. A diferencia del ARN, las ADN polimerasas no pueden sintetizar ADN a partir de una cadena molde. La síntesis debe iniciarse mediante un segmento corto de ARN, conocido como cebador de ARN , sintetizado por Primase en la dirección 5' a 3'. La síntesis de ADN se produce entonces mediante la adición de un dNTP al grupo hidroxilo 3' al final de la cadena de ADN preexistente o cebador de ARN. En segundo lugar, las ADN polimerasas solo pueden agregar nuevos nucleótidos a la cadena preexistente a través de enlaces de hidrógeno. [6] Dado que todas las ADN polimerasas tienen una estructura similar, todas comparten un mecanismo de polimerasa catalizado por dos iones metálicos. Uno de los iones metálicos activa el grupo hidroxilo 3' del cebador, que luego ataca el fosfato 5' primario del dNTP. El segundo ion metálico estabilizará la carga negativa del oxígeno saliente y, posteriormente, formará quelatos entre los dos grupos fosfato salientes. [8]
Las estructuras cristalinas de rayos X de los dominios de polimerasa de las ADN polimerasas se describen de forma análoga a la mano derecha humana. Todas las ADN polimerasas contienen tres dominios. El primer dominio, conocido como el "dominio de los dedos", interactúa con el dNTP y la base molde emparejada. El "dominio de los dedos" también interactúa con la plantilla para colocarla correctamente en el sitio activo. [9] Conocido como el "dominio de la palma", el segundo dominio cataliza la reacción de transferencia del grupo fosforilo. Por último, el tercer dominio, conocido como el "dominio del pulgar", interactúa con el ADN bicatenario. [10] El dominio de la exonucleasa contiene su propio sitio catalítico y elimina las bases mal emparejadas. Entre las siete familias diferentes de ADN polimerasas, el "dominio de la palma" se conserva en cinco de estas familias. El "dominio de los dedos" y el "dominio del pulgar" no son consistentes en cada familia debido a la variación de los elementos de estructura secundaria de diferentes secuencias. [9]
La Pol I posee cuatro actividades enzimáticas:
Para determinar si la Pol I se utilizaba principalmente para la replicación del ADN o para reparar el daño del ADN, se realizó un experimento con una cepa mutante deficiente de Pol I de E. coli . La cepa mutante que carecía de Pol I se aisló y se trató con un mutágeno. La cepa mutante desarrolló colonias bacterianas que continuaron creciendo normalmente y que también carecían de Pol I. Esto confirmó que la Pol I no era necesaria para la replicación del ADN. Sin embargo, la cepa mutante también mostró características que implicaban una sensibilidad extrema a ciertos factores que dañaban el ADN, como la luz ultravioleta . Por lo tanto, esto reafirmó que era más probable que la Pol I estuviera involucrada en la reparación del daño del ADN en lugar de la replicación del ADN. [6]
En el proceso de replicación, la ARNasa H elimina el cebador de ARN (creado por la primasa ) de la cadena rezagada y luego la polimerasa I rellena los nucleótidos necesarios entre los fragmentos de Okazaki (ver replicación de ADN ) en una dirección 5'→3', corrigiendo los errores a medida que avanza. Es una enzima dependiente de la plantilla: solo agrega nucleótidos que se aparean correctamente con una cadena de ADN existente que actúa como plantilla. Es crucial que estos nucleótidos estén en la orientación y geometría adecuadas para aparearse con la cadena de plantilla de ADN para que la ADN ligasa pueda unir los diversos fragmentos en una cadena continua de ADN . Los estudios de la polimerasa I han confirmado que diferentes dNTP pueden unirse al mismo sitio activo en la polimerasa I. La polimerasa I puede discriminar activamente entre los diferentes dNTP solo después de sufrir un cambio conformacional . Una vez que se ha producido este cambio, la Pol I verifica la geometría y la alineación adecuadas del par de bases, formado entre el dNTP unido y una base coincidente en la cadena de plantilla. La geometría correcta de los pares de bases A=T y G≡C son los únicos que pueden caber en el sitio activo . Sin embargo, es importante saber que uno de cada 10 4 a 10 5 nucleótidos se añade de forma incorrecta. No obstante, la Pol I puede corregir este error en la replicación del ADN utilizando su método selectivo de discriminación activa. [5]
A pesar de su caracterización temprana, rápidamente se hizo evidente que la polimerasa I no era la enzima responsable de la mayor parte de la síntesis de ADN: la replicación del ADN en E. coli se produce a aproximadamente 1000 nucleótidos/segundo, mientras que la tasa de síntesis de pares de bases por la polimerasa I promedia solo entre 10 y 20 nucleótidos/segundo. Además, su abundancia celular de aproximadamente 400 moléculas por célula no se correlacionaba con el hecho de que típicamente solo hay dos horquillas de replicación en E. coli . Además, no es lo suficientemente procesiva para copiar un genoma completo , ya que se cae después de incorporar solo 25-50 nucleótidos . Su papel en la replicación se demostró cuando, en 1969, John Cairns aisló un mutante viable de la polimerasa I que carecía de la actividad de la polimerasa. [12] La asistente de laboratorio de Cairns, Paula De Lucia, creó miles de extractos libres de células de colonias de E. coli y los analizó para determinar la actividad de la ADN-polimerasa. El clon 3.478 contenía el mutante polA , que Cairns bautizó con ese nombre en honor a "Paula" [De Lucia]. [13] No fue hasta el descubrimiento de la ADN polimerasa III que se identificó finalmente la principal ADN polimerasa replicativa.
La ADN polimerasa I obtenida de E. coli se utiliza ampliamente en la investigación de biología molecular . Sin embargo, la actividad exonucleasa 5'→3' la hace inadecuada para muchas aplicaciones. Esta actividad enzimática indeseable se puede eliminar simplemente de la holoenzima para dejar una molécula útil llamada fragmento Klenow , ampliamente utilizado en biología molecular . De hecho, el fragmento Klenow se utilizó durante los primeros protocolos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) hasta que se descubrió Thermus aquaticus , la fuente de una Taq Polimerasa I tolerante al calor , en 1976. [15] La exposición de la ADN polimerasa I a la proteasa subtilisina escinde la molécula en un fragmento más pequeño, que retiene solo las actividades de la ADN polimerasa y de corrección de pruebas.
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