La ribozima cabeza de martillo es un motivo de ARN que cataliza reacciones reversibles de ligadura y escisión en un sitio específico dentro de una molécula de ARN. Es uno de varios ARN catalíticos ( ribozimas ) que se sabe que se encuentran en la naturaleza. Sirve como sistema modelo para la investigación sobre la estructura y propiedades del ARN, y se utiliza para experimentos de escisión de ARN dirigidos, algunos de ellos con aplicaciones terapéuticas propuestas. Llamadas así por el parecido de los primeros diagramas de estructura secundaria con los de un tiburón martillo , [1] las ribozimas de tiburón martillo se descubrieron originalmente en dos clases de ARN similares a virus de plantas: ARN satélite y viroides . También se conocen en algunas clases de retrotransposones , incluidas las retrozimas . [2] El motivo de la ribozima del pez martillo se ha informado de forma ubicua en linajes de todo el árbol de la vida. [3] [4]
Las reacciones de autoescisión, reportadas por primera vez en 1986, [5] [6] son parte de un mecanismo de replicación en círculo rodante . La secuencia del martillo es suficiente para la autoescisión [7] y actúa formando una estructura terciaria tridimensional conservada.
En su estado natural, un motivo de ARN de cabeza de martillo es una sola hebra de ARN. Aunque la escisión tiene lugar en ausencia de enzimas proteicas , el ARN del tiburón martillo en sí no es un catalizador en su estado natural, ya que es consumido por la reacción (es decir, realiza una autoescisión) y, por lo tanto, no puede catalizar múltiples recambios.
Las construcciones de cabeza de martillo de acción trans se pueden diseñar de modo que consten de dos hebras de ARN que interactúan, una de las cuales compone una ribozima de cabeza de martillo que escinde la otra hebra. [8] [ cita necesaria ] La hebra que se escinde se puede suministrar en exceso, y se puede demostrar que el recambio múltiple obedece a la cinética de Michaelis-Menten , [8] [ cita necesaria ] típica de la cinética de enzimas proteicas . Tales construcciones se emplean típicamente para experimentos in vitro , y el término "ARN cabeza de martillo" se ha convertido en la práctica en sinónimo de la " ribozima cabeza de martillo " más frecuentemente utilizada.
La secuencia mínima de ribozima de cabeza de martillo de acción trans que es catalíticamente activa consta de tres tallos con pares de bases que flanquean un núcleo central de 15 nucleótidos conservados (en su mayoría invariantes) , como se muestra. Las bases centrales conservadas, con pocas excepciones, son esenciales para la actividad catalítica de la ribozima. Tales construcciones de ribozima de cabeza de martillo exhiben in vitro una tasa de recambio ( kcat) de aproximadamente 1 molécula/minuto y una Km del orden de 10 nanomolar.
La ribozima del tiburón martillo es posiblemente la ribozima mejor caracterizada. Su pequeño tamaño, su química de escisión minuciosamente investigada, su estructura cristalina conocida y su relevancia biológica hacen que la ribozima de cabeza de martillo sea particularmente adecuada para investigaciones bioquímicas y biofísicas sobre la naturaleza fundamental de la catálisis del ARN.
Las ribozimas de cabeza de martillo pueden desempeñar un papel importante como agentes terapéuticos; como enzimas que adaptan secuencias de ARN definidas, como biosensores y para aplicaciones en genómica funcional y descubrimiento de genes. [9]
En 1986, se encontraron las primeras ribozimas de tiburón martillo en patógenos vegetales de ARN, como viroides y satélites virales. [5] [6] Un año después, también se informó de una ribozima de tiburón martillo en el ADN satélite de los genomas de los tritones. [10] Luego se encontraron nuevos ejemplos de esta ribozima en los genomas de organismos no relacionados como los esquistosomas, [11] los grillos de las cavernas, [12] Arabidopsis thaliana [13] y algunos mamíferos como los roedores y el ornitorrinco. [14] En 2010, se descubrió que la ribozima del tiburón martillo se encuentra en una amplia variedad de genomas bacterianos y eucariotas, [15] e incluso en humanos. [16] Informes similares confirmaron y ampliaron estas observaciones, [17] [18] [19] revelando la ribozima del tiburón martillo como un ARN catalítico ubicuo en todos los reinos de la vida. [20]
La mayoría de las ribozimas de cabeza de martillo eucariotas están relacionadas con una especie de retroelementos cortos intercalados (SINE) llamados retrozimas , que se expresan como pequeños ARN circulares. [21] Sin embargo, en los genomas de todos los amniotas se puede encontrar un grupo excepcional de tiburones martillo sorprendentemente conservados . [16] Estas ribozimas de cabeza de martillo (las llamadas HH9 y HH10) se encuentran en los intrones de algunos genes específicos y apuntan a un papel biológico preservado durante la biosíntesis del pre-ARNm. [22] En 2021, se descubrió que nuevos genomas del virus de la hepatitis D de ARN circular de diversos animales codificaban ribozimas de cabeza de martillo similares a las presentes en los viroides de plantas y los satélites virales. [23] Una búsqueda bioinformática masiva de agentes similares a los deltavirus en todo el mundo ha descubierto cientos de ejemplos de genomas de ARN circulares que portan motivos de cabeza de martillo, lo que indica que no sólo esta ribozima sino también pequeños ARN circulares con ribozimas son moléculas ubicuas en la biosfera. [24]
La ribozima cabeza de martillo lleva a cabo una reacción química muy simple que resulta en la rotura de la cadena sustrato del ARN, específicamente en C17, el nucleótido del sitio de escisión. Aunque la escisión del ARN a menudo se denomina hidrólisis , el mecanismo empleado en realidad no implica la adición de agua . Más bien, la reacción de escisión es simplemente una isomerización que consiste en una reordenación del enlace fosfodiéster de enlace . Es la misma reacción, químicamente, que ocurre con la degradación aleatoria del ARN mediada por bases , excepto que es altamente específica del sitio y la velocidad se acelera 10.000 veces o más.
La reacción de escisión es una reacción de isomerización de fosfodiéster que se inicia mediante la abstracción del protón 2'-hidroxilo de la ribosa del sitio de escisión del oxígeno 2', que luego se convierte en el nucleófilo atacante en un proceso "en línea" o S N 2 (P). ) , aunque no se sabe si este protón se elimina antes o durante el paso químico de la reacción de escisión del tiburón martillo. (La reacción de escisión técnicamente no es bimolecular , pero se comporta de la misma manera que una auténtica reacción S N 2 (P); sufre una inversión de configuración después de formar un estado de transición asociativo que consiste en un oxifosfrano pentacoordinado). Los oxígenos del grupo ocuparán las dos posiciones axiales en la estructura de estado de transición bipiramidal trigonal , como se requiere para un mecanismo de reacción similar al S N 2.
El producto 5', como resultado de este mecanismo de reacción de escisión, posee un extremo fosfato cíclico 2',3', y el producto 3' posee un extremo 5'-OH, como ocurre con la escisión alcalina no enzimática de ARN. Por lo tanto, la reacción es reversible, ya que el fosfato escindible sigue siendo un fosfodiéster y, por lo tanto, puede actuar como sustrato para la ligadura mediada por ARN del tiburón martillo sin necesidad de ATP o una fuente de energía exógena similar. [25] La reacción catalizada por ribozima de cabeza de martillo, a diferencia de la escisión alcalina no enzimática formalmente idéntica del ARN, es una reacción de escisión altamente específica de secuencia con una tasa de recambio típica de aproximadamente 1 molécula de sustrato por molécula de enzima por minuto a pH 7,5. en Mg 2+ 10 mM (las denominadas "condiciones de reacción estándar" para la secuencia mínima de ARN de cabeza de martillo), dependiendo de la secuencia de la construcción de ribozima de cabeza de martillo particular medida. Esto representa una mejora de la velocidad de aproximadamente 10.000 veces con respecto a la escisión no enzimática del ARN.
Originalmente se pensó que todas las ribozimas eran metaloenzimas . Se suponía que los iones metálicos divalentes como el Mg 2+ tenían dos funciones: promover el plegamiento adecuado del ARN y formar el núcleo catalítico. [26] Dado que el ARN en sí no contenía suficiente variación en los grupos funcionales, se pensó que los iones metálicos desempeñaban un papel en el sitio activo, como se sabía sobre las proteínas. El mecanismo propuesto para el ion Mg2+ fue: la desprotonación del grupo 2'-OH por un complejo de magnesio.aqua.hidroxi unido por el oxígeno pro-R en el sitio de escisión del fosfato, seguido por el ataque nucleofílico del ion 2'-OH resultante. alcaóxido sobre el fosfato escindible formando un intermedio de fosfato pentacoordinado. El último paso es la salida del grupo saliente 5', produciendo un fosfato 2',3'-cíclico con una configuración invertida. [27]
Se suponía que los iones de magnesio hexahidratados , que existen en equilibrio con el hidróxido de magnesio , podrían desempeñar las funciones de ácido general y base general , de forma análoga a las desempeñadas por dos histidinas en la ARNasa A. También se ha propuesto un papel adicional para los iones metálicos divalentes en forma de estabilización electrostática del estado de transición .
En 1998 se descubrió [28] que la ribozima de cabeza de martillo, así como la ribozima VS y la ribozima de horquilla , no requieren la presencia de iones metálicos para la catálisis, siempre que esté presente una concentración suficientemente alta de catión monovalente para permitir que el ARN se pliegue. . Este descubrimiento sugirió que el propio ARN, en lugar de servir como un andamio pasivo e inerte para la unión de iones metálicos divalentes químicamente activos, está íntimamente involucrado en la química de la catálisis. Los últimos resultados estructurales, que se describen a continuación, confirman de hecho que dos nucleótidos invariantes, G12 y G8, están posicionados de manera consistente con sus funciones como base general y ácido general en la reacción de escisión del tiburón martillo.
Por lo tanto, estrictamente hablando, la ribozima del pez martillo no puede ser una metaloenzima.
La secuencia mínima de cabeza de martillo que se requiere para la reacción de autoescisión incluye aproximadamente 13 nucleótidos "centrales" conservados o invariantes, la mayoría de los cuales no participan en la formación de pares de bases canónicos de Watson-Crick . La región central está flanqueada por los tallos I, II y III, que en general están formados por pares de bases canónicos de Watson-Crick pero que, por lo demás, no están restringidos con respecto a la secuencia. La tasa de recambio catalítico de las ribozimas mínimas de cabeza de martillo es ~ 1/min (comúnmente se observa un rango de 0,1/min a 10/min, dependiendo de las secuencias no conservadas y las longitudes de los tres tallos helicoidales) en condiciones de reacción estándar con alto contenido de Mg 2 + (~10 mM), pH 7,5 y 25 °C. Gran parte del trabajo experimental realizado con ribozimas de tiburón martillo ha utilizado una construcción mínima.
Estructuralmente, la ribozima de cabeza de martillo está compuesta por hélices de tres pares de bases, separadas por enlaces cortos de secuencias conservadas. Estas hélices se denominan I, II y III. Las ribozimas de cabeza de martillo se pueden clasificar en tres tipos según la hélice en la que se encuentren los extremos 5' y 3'. Si los extremos 5' y 3' de la secuencia contribuyen al tallo I, entonces es una ribozima de cabeza de martillo de tipo I, al tallo II. es una ribozima de tipo II y para la raíz III entonces es una ribozima de cabeza de martillo de tipo III. De los tres tipos topológicos posibles, el tipo I se puede encontrar en los genomas de procariotas, eucariotas y patógenos vegetales de ARN, mientras que el tipo II solo se ha descrito en procariotas [18] [19] y el tipo III se encuentra principalmente en plantas, patógenos vegetales. y procariotas. [20] [22]
La ribozima de cabeza de martillo de longitud completa consta de elementos de secuencia adicionales en los tallos I y II que permiten que se formen contactos terciarios adicionales. Las interacciones terciarias estabilizan la conformación activa de la ribozima, lo que da como resultado tasas de escisión hasta 1000 veces mayores que las de las correspondientes secuencias mínimas de cabeza de martillo. [29] [30]
La ribozima mínima del tiburón martillo ha sido estudiada exhaustivamente por bioquímicos y enzimólogos, así como por cristalógrafos de rayos X, espectroscopistas de RMN y otros practicantes de técnicas biofísicas. La primera información estructural tridimensional detallada de una ribozima de cabeza de martillo apareció en 1994 en forma de una estructura cristalina de rayos X de una ribozima de cabeza de martillo unida a un análogo de sustrato de ADN, publicada en Nature por Pley, Flaherty y McKay. [31] Posteriormente, Scott, Finch y Klug publicaron en Cell a principios de 1995 una estructura mínima de ribozima de cabeza de martillo totalmente de ARN . [32]
La ribozima mínima de cabeza de martillo está compuesta por hélices de tres pares de bases, separadas por enlaces cortos de secuencia conservada como se muestra en la estructura cristalina . [32] Estas hélices se denominan I, II y III. El giro de uridina conservado une la hélice I con la hélice II y normalmente contiene la secuencia CUGA. Las hélices II y III están unidas por una secuencia GAAA. La reacción de escisión ocurre entre las hélices III y I, y suele ser una C.
La estructura de una ribozima de longitud completa muestra que existen numerosas interacciones entre el bucle del tallo II y el tallo I. [33]
Se observan estructuras similares en otras ribozimas, como las ribozimas de hacha .
A pesar de las observaciones de la catálisis de ribozimas de cabeza de martillo en un cristal de la secuencia mínima de cabeza de martillo en la que los contactos de empaquetamiento de la red cristalina confinan por necesidad las posiciones globales de los extremos distales de los tres tallos helicoidales flanqueantes, muchos experimentos bioquímicos diseñados para investigar las interacciones entre estados de transición y la química de la catálisis parecía irreconciliable con las estructuras cristalinas.
Por ejemplo, se observó que los residuos centrales invariantes G5, G8, G12 y C3 en la ribozima mínima de cabeza de martillo eran tan frágiles que cambiar incluso un solo grupo funcional exocíclico en cualquiera de estos nucleótidos da como resultado una reducción o abolición dramática de la actividad catalítica. Sin embargo, pocos de ellos parecían formar enlaces de hidrógeno que involucraran las caras de Watson-Crick de estas bases de nucleótidos en cualquiera de las estructuras mínimas del cabeza de martillo, aparte de una interacción G-5 en la estructura del producto.
Un ejemplo particularmente llamativo y observado recientemente fue el de G8 y G12, que fueron identificados como posibles participantes en la catálisis ácido-base. Una vez que se demostró que el ARN del cabeza de martillo no requiere iones metálicos divalentes para la catálisis, gradualmente se hizo evidente que el propio ARN, en lugar de los iones metálicos divalentes unidos pasivamente, debe desempeñar un papel químico directo en cualquier química ácido-base en la ribozima del cabeza de martillo. sitio activo. Sin embargo, no estaba del todo claro cómo G12 y G8 podrían lograr esto, dadas las estructuras originales de la ribozima mínima del tiburón martillo.
Otras preocupaciones incluyeron un NOE entre U4 y U7 de la ribozima escindida del pez martillo que también se había observado durante la caracterización por RMN , lo que sugería que estas bases de nucleótidos debían aproximarse entre sí a menos de aproximadamente 6 Å, aunque el acercamiento cercano de U7 a U4 no parecía ser posible a partir de la estructura cristalina. Finalmente, como se discutió anteriormente, el nucleófilo atacante en las estructuras originales, el 2'-OH de C17, no estaba en una posición susceptible de atacar en línea sobre el fosfato escindible adyacente .
Quizás lo más preocupante fueron los experimentos que sugirieron que el A-9 y los fosfatos escindibles debían estar a una distancia de aproximadamente 4 Å entre sí en el estado de transición, basándose en experimentos de doble sustitución de fosforotioato y rescate de iones de metales blandos; la distancia entre estos fosfatos en la estructura cristalina mínima del cabeza de martillo era de aproximadamente 18 Å, sin un mecanismo claro para un acercamiento cercano si las hélices en forma de A del vástago II y del vástago I se trataran como cuerpos rígidos. En conjunto, estos resultados parecieron sugerir que debe haber tenido lugar un cambio conformacional a bastante gran escala para alcanzar el estado de transición dentro de la estructura mínima de ribozima de cabeza de martillo.
Por estas razones, los dos conjuntos de experimentos (bioquímico versus cristalográfico) parecían no sólo estar en desacuerdo, sino que eran total y irremediablemente irreconciliables, generando una cantidad sustancial de discordia en el campo. Nunca se logró presentar con éxito ninguna prueba convincente para descartar ninguno de los conjuntos de resultados experimentales, aunque se hicieron muchas afirmaciones en sentido contrario a favor de cada uno de ellos.
En 2006 se obtuvo una estructura cristalina de resolución de 2,2 Å de la ribozima de cabeza de martillo de longitud completa. Esta nueva estructura (que se muestra a la derecha) parece resolver la más preocupante de las discrepancias anteriores. En particular, C17 ahora está posicionado para el ataque en línea, y los residuos invariantes C3, G5, G8 y G12 parecen estar involucrados en interacciones vitales relevantes para la catálisis. Además, se observa que los fosfatos A9 y escindibles están separados por 4,3 Å, lo que concuerda con la idea de que, cuando se modifican, estos fosfatos podrían unirse a un solo ion metálico tiofílico. La estructura también revela cómo dos residuos invariantes, G-12 y G-8, se colocan dentro del sitio activo de acuerdo con su papel previamente propuesto en la catálisis ácido/base. G12 está dentro de la distancia de enlace de hidrógeno al 2'-O de C17, el nucleófilo en la reacción de escisión, y la ribosa de los enlaces de hidrógeno G8 al grupo saliente 5'-O. (ver más abajo), mientras que la base de nucleótidos de G8 forma un par Watson-Crick con el invariante C3. Esta disposición permite sugerir que G12 es la base general en la reacción de escisión y que G8 puede funcionar como el ácido general, de acuerdo con observaciones bioquímicas previas. El hidrógeno G5 se une al oxígeno furanosa del C17, lo que ayuda a posicionarlo para el ataque en línea. U4 y U7, como consecuencia de la formación de pares de bases entre G8 y C3, ahora están posicionados de manera que se explica fácilmente un NOE entre sus bases.
La estructura cristalina de la ribozima de cabeza de martillo de longitud completa aborda claramente todas las preocupaciones principales que parecían irreconciliables con las estructuras cristalinas anteriores de la ribozima de cabeza de martillo mínima.
Las interacciones terciarias en la ribozima completa del cabeza de martillo estabilizan lo que parece ser la conformación activa. El nucleófilo, el oxígeno 2' del nucleótido del sitio de escisión, C17, está alineado casi perfectamente para un ataque en línea (la reacción SN 2 (P)). G12 se encuentra dentro de la distancia de enlace de hidrógeno de este nucleófilo y, por lo tanto, podría extraer un protón del oxígeno 2' si el propio G12 se desprotona. El 2'-OH de G8 forma un enlace de hidrógeno con el oxígeno del grupo saliente 5' y, por lo tanto, potencialmente puede suministrar un protón a medida que se acumula carga negativa en el oxígeno 5' de la ribosa de A1.1.
La explicación más probable es entonces que G12, en la forma desprotonada, sea la base general, y la ribosa de G8 sea el ácido general. El pKa cinético aparente [ se necesita aclaración ] de la ribozima del pez martillo es 8,5, mientras que el pKa de la guanosina es aproximadamente 9,5. Es posible que el pKa de G12 esté perturbado de 9,5 a 8,5 en el núcleo catalítico del martillo; Esta hipótesis es actualmente objeto de intensa investigación.
Si el invariante G8 se cambia a C8, se elimina la catálisis del tiburón martillo. Sin embargo, un doble mutante G8C + C3G que mantiene el par de bases G8-C3 que se encuentra en el tiburón martillo de longitud completa restaura la mayor parte de la actividad catalítica. También se ha observado que el 2'-OH del G8 es esencial para la catálisis; la sustitución de G8 por desoxiG8 reduce en gran medida la velocidad de catálisis, lo que sugiere que el 2'-OH es crucial para el mecanismo catalítico.
El acercamiento cercano del A9 y los fosfatos escindibles requiere la presencia de una alta concentración de carga positiva. Esta es probablemente la fuente de la observación de que se requieren iones metálicos divalentes con fuerza iónica baja, pero se puede prescindir de ellos en concentraciones más altas de cationes monovalentes.
Por lo tanto, es probable que la reacción implique la abstracción del protón 2' del C17, seguida de un ataque nucleofílico sobre el fosfato adyacente. A medida que el enlace entre el fósforo escindible y el grupo saliente 5'-O comienza a romperse, se suministra un protón desde la ribosa de G8, que luego probablemente reprotona a expensas de una molécula de agua que se observa formando un enlace de hidrógeno con ella en la estructura cristalina. .
Se están probando ribozimas modificadas de tiburón martillo como agentes terapéuticos. [34] Los ARN sintéticos que contienen secuencias complementarias al ARNm de SOD1 mutante y las secuencias necesarias para formar la estructura catalítica del cabeza de martillo se están estudiando como una posible terapia para la esclerosis lateral amiotrófica . También se está trabajando para descubrir si podrían usarse para diseñar líneas de células T resistentes al VIH . Se ha demostrado que los adenovirus de ribozima de cabeza de martillo modificados son potentes en el tratamiento del cáncer tanto in vitro como in vivo. [35]
El uso terapéutico de las ribozimas de cabeza de martillo transescindibles se ha visto gravemente obstaculizado por su bajo nivel de actividad in vivo . El verdadero potencial catalítico de las ribozimas de cabeza de martillo transescindibles puede recuperarse in vivo y es probable que los derivados terapéuticos complementen otras estrategias terapéuticas de hibridación de ácidos nucleicos. Ya existen ribozimas de tiburón martillo que están cercanas a la aplicación clínica. [9]