Antecedentes: La ribozima hacha es una estructura de ARN que cataliza su propia escisión en un sitio específico. En otras palabras, es una ribozima que se autoescinde . Las ribozimas Hatchet fueron descubiertas mediante una estrategia bioinformática [1] como ARN asociados con genes asociados con ribozimas Twister y Hammerhead, o RAGATH .
Un análisis bioquímico posterior confirmó la existencia de una función ribozima y determinó otras características de la reacción química catalizada por la ribozima. [2]
Las ribozimas nucleolíticas son pequeños ARN que adoptan pliegues compactos capaces de realizar reacciones de escisión/ligación específicas de un sitio. Hasta la fecha se han identificado 14 ribozimas nucleolíticas únicas, incluidas las ribozimas tornado , pistola , hermana tornado y hacha recientemente descubiertas que se identificaron basándose en la aplicación de secuencias comparativas y algoritmos estructurales.
La secuencia consenso y la estructura secundaria de esta clase incluyen 13 nucleótidos altamente conservados y muchos otros nucleótidos modestamente conservados interdispersados entre protuberancias que unen cuatro subestructuras de pares de bases. Una ribozima de hacha representativa requiere cationes divalentes como Mg 2+ para promover la escisión de la cadena de ARN con una velocidad máxima constante de ~4/min. Como ocurre con todas las demás ribozimas pequeñas autoescindibles descubiertas hasta la fecha, las ribozimas de hacha emplean un mecanismo general de catálisis que consiste en un ataque nucleofílico de un átomo de oxígeno 2 ′ de ribosa en el centro de fósforo adyacente. Las características cinéticas de la reacción demuestran que los miembros de esta clase de ribozimas tienen un requisito esencial de cationes metálicos divalentes y que tienen un sitio activo complejo que emplea múltiples estrategias catalíticas para acelerar la escisión del ARN mediante transferencia interna de fosfoéster. [3]
Las ribozimas nucleolíticas como Hatchet Ribozyme adoptan un mecanismo similar a SN2 que da como resultado la escisión del enlace fosfodiéster en un sitio específico. Un 2 ′ -OH activado de la ribosa 5 ′ con respecto al fosfato escindible adopta una alineación en línea para apuntar al enlace fosfodiéster P-O5 ′ adyacente que se va a escindir , lo que resulta en la formación de 2 ′ ,3 ′ -fosfato cíclico y Grupos 5′ - OH. Los estudios estructurales cristalográficos de rayos X de las ribozimas cabeza de martillo , horquilla , GlmS , virus de la hepatitis delta (HDV), satélite Varkud y pistola han definido el pliegue general del ARN, la disposición de la bolsa catalítica, la alineación en línea y los residuos clave que Contribuir a la reacción de escisión. El sitio de escisión está ubicado en el extremo 5' de su motivo secundario de consenso. [4]
Además, la eliminación del hidroxilo nucleofílico inactiva la ribozima ya que no es capaz de crear el sitio de escisión. Más específicamente, si la 2'-ribosa o 2'-OH se reemplaza por una 2'-desoxirribosa o 2'-H, no hay electrones disponibles para realizar el ataque nucleofílico al grupo fosfato adyacente. Esto da como resultado que no se forme ningún enlace fosfoéster, lo que nuevamente inactiva la capacidad de escisión enzimática de la ribozima.
En 2019, los investigadores cristalizaron un producto de 2,1 Å de Hatchet Ribozyme. La secuencia de consenso se muestra en la imagen de la derecha. La mayoría de las ribozimas de hacha y las ribozimas en general adoptan una configuración P0. P0 es un bucle en horquilla adicional ubicado en el extremo 5' del sitio de escisión, aunque no contribuye a la actividad o funcionalidad catalítica, a diferencia de las ribozimas Hammerhead que tienen una secuencia consenso corta cerca de P1, o el extremo 5', que promueve la actividad catalítica de alta velocidad. actividad. Aproximadamente el 90% de la secuencia está conservada y es similar a otras ribozimas de esta clase. [1]
Basado en la secuencia de ARN, la secuencia de ADN resultante que termina codificando la ribozima Hatchet es la siguiente de 5'-3' porque en el ADN el uracilo se reemplaza por timina.
TTAGCAAGAATGACTATAGTCACTG TTTGTACACCCCGAATAGATTAGAA GCCTAATCATAATCACGTCTGCAAT TTTGGTACA
Debido a esta construcción de secuencia, después de la escisión autocatalizada, deja un residuo de 8 nucleótidos aguas arriba en el extremo 3' del ARN. [5]
Cada ribozima puede tener diferentes motivos y, por tanto, diferentes estructuras terciarias:
La estructura terciaria de la ribozima Hatchet con el motivo HT-UUCG se realiza mediante dimerización. El dímero se forma mediante el intercambio de los extremos 3' de las hebras de emparejamiento, que también está en equilibrio con el producto formado por el dímero de HT-GAAA. Por lo tanto, la secuencia de ARN cambia entre configuraciones de monómero y dímero. Para ver la forma tridimensional de la ribozima, consulte la Figura S1A y B. [4] Dos moléculas de la ribozima HT-GAAA en realidad pueden formar un dímero pseudosimétrico y ambos monómeros de la ribozima exhiben una densidad electrónica relativamente bien definida. El pliegue terciario consta de cuatro subestructuras de tallo que se apilan covalentemente entre sí formando las estructuras helicoidales y de bucle, llamadas P1, P2, P3 y P4, L1, L2 y L3 respectivamente (aunque no se muestran en la figura anterior). El sitio de escisión real está situado entre la unión de P1 y P2 adyacente a P3 y L2. P1 se compone de tres o seis pares de bases aproximadamente el 40% y el 60% del tiempo respectivamente en su estado natural, lo que sugiere que la longitud corresponde a la función catalítica. [3]
También hay una secuencia palindrómica conservada entre las bases U70' y A67', que probablemente desencadena la formación del dímero debido a las interacciones del par de bases Watson-Crick .
La estructura terciaria también tiene implicaciones de largo alcance dentro de sí misma basadas en las interacciones entre sus bucles. [4]
Los experimentos de catálisis con ribozima se realizaron mediante la adición de MgCl 2 y se detuvieron para medir en cada momento mediante la adición de una solución de parada que contenía urea y EDTA.
Un gráfico de los valores de kobs medidos a pH 7,5 con concentraciones crecientes de Mg 2+ . Hay un fuerte aumento en la función de las ribozimas que se estabiliza a medida que la concentración se acerca a 10 mM. La pronunciada pendiente observada a concentraciones más bajas de Mg 2+ sugiere que se necesita más de un ion metálico para que cada ARN alcance la máxima actividad de ribozima. Además, esto sugiere que la construcción requiere concentraciones fisiológicas de Mg 2+ superiores a las normales para saturarse completamente con Mg 2+ como cofactor. Es posible que las construcciones unimoleculares nativas, que también transportan P0, puedan alcanzar la saturación en concentraciones de Mg 2+ más cercanas a los niveles fisiológicos normales.
También se midió experimentalmente el efecto del pH sobre la constante de velocidad de ribozima en reacciones que contienen Mg 2+ 10 mM. La actividad de la ribozima dependiente del pH aumenta linealmente con una pendiente de 1 hasta alcanzar un kobs , de una gráfica de Michaelis-Menten , meseta de ~4/min cerca de un valor de pH de 7,5. Cualquier pH más alto tiene el mismo efecto catalítico y un pH más ácido comienza a desnaturalizar la ribozima y, por lo tanto, reduce la función catalítica. Tanto la dependencia del pH como la constante de velocidad máxima tienen implicaciones interesantes para las posibles estrategias catalíticas utilizadas por esta clase de ribozimas. [3]
La construcción de ribozima Hatchet permanece completamente inactiva cuando se incuba en ausencia de Mg 2+ en reacciones que contienen sólo otros cationes monovalentes en 1 M (Na + , K + , Rb + , Li + , Cs + ), 2,5 M (Na + , K + ), o 3 M (Li + ). Por el contrario, otros iones metálicos divalentes como Mn 2+ , Co 2+ , Zn 2+ y Cd 2+ apoyan la función de la ribozima con distintos niveles de eficiencia. Además, dos iones metálicos (Zn 2+ , Cd 2+ ) funcionan sólo en concentraciones bajas, y tres iones metálicos (Ba 2+ , Ni 2+ y Cu 2+ ) inhiben la actividad a 0,5 mM, incluso cuando Mg 2+ es presente. Estos resultados indican que las ribozimas hacha son relativamente restrictivas en el uso de cationes para promover la catálisis, lo que quizás indica que uno o más sitios de unión especializados que acomodan un número limitado de cationes divalentes están presentes en la estructura del ARN o quizás incluso en el sitio activo. La inhibición por ciertos iones metálicos divalentes podría deberse al desplazamiento de iones críticos de Mg 2+ o a una alteración general del plegamiento del ARN. [3]
Una aplicación estándar es utilizar ribozimas autoescindibles flanqueantes para generar secuencias cortadas con precisión de moléculas de ARN funcionales (es decir, shRNA , saiRNA , sgRNA ). Esto es especialmente útil para la expresión in vivo de sistemas de edición de genes (es decir, CRISPR / Cas sgRNA ) y sistemas inhibidores. [6]
Otro método es el de la transcripción in vivo de ARNip . Este diseño utiliza múltiples ribozimas autoescindibles, todas transcritas del mismo gen. Después de la escisión, ambas partes del ARNip precursor (ARNip 1 y 2) pueden formar una doble hebra y actuar según lo previsto. Para ver la configuración, consulte el gráfico de saiRNA [7]
Por último, si desea combinar ribozimas autoescindibles con secuencias de proteínas, es importante saber que el mecanismo de autoescisión de las ribozimas modificará el ARNm. Una ribozima 5' modificará el extremo 5' aguas abajo del pre-ARNm, impidiendo que la célula cree una tapa 5'. Esto disminuye la estabilidad del pre-ARNm y evita que sea un ARNm maduro completamente funcional. Por otro lado, una ribozima 3' impediría la poliadenilación del pre-ARNm aguas arriba, disminuyendo nuevamente la estabilidad y previniendo la maduración. Ambos también interfieren con la traducción. [5]