La fusión de beso y fuga es un tipo de liberación de vesículas sinápticas en la que la vesícula se abre y se cierra transitoriamente. En esta forma de exocitosis , la vesícula se acopla y se fusiona transitoriamente en la membrana presináptica y libera sus neurotransmisores a través de la sinapsis , después de lo cual la vesícula puede reutilizarse. [1] [2]
El beso y fuga se diferencia de la fusión completa, en la que la vesícula colapsa completamente en la membrana plasmática y luego se recupera mediante un proceso dependiente de la capa de clatrina . [3] La idea de que el neurotransmisor podría liberarse en "cuantos" por la fusión de vesículas sinápticas con la membrana presináptica fue introducida por primera vez por Bernard Katz y José del Castillo en 1955, cuando aparecieron las primeras imágenes EM de terminales nerviosas. La posibilidad de fusión transitoria y recuperación rápida de la membrana de la vesícula fue propuesta por Bruno Ceccarelli en 1973, después de examinar en el microscopio electrónico las uniones neuromusculares de rana fuertemente estimuladas, y apoyada indirectamente por el trabajo de su grupo en los años siguientes, utilizando técnicas de electrofisiología, microscopía electrónica y congelación rápida. El término real, beso y fuga, fue introducido por los colaboradores de Ceccarelli [2] después de que se realizaran los primeros estudios de capacitancia de membrana simultánea y mediciones amperométricas de liberación de transmisores que indicaron que los productos secretores realmente podrían liberarse durante la fusión transitoria de vesículas. [4] Hoy en día, existe un debate de ida y vuelta sobre la fusión completa y la fusión de beso y fuga y qué modelo retrata una imagen más precisa de los mecanismos detrás de la liberación sináptica. [5] La mayor acumulación de vesículas secretoras parcialmente vacías después de la secreción, observada en micrografías electrónicas, es la evidencia más convincente a favor del modelo de beso y fuga. La acumulación de vesículas parcialmente vacías después de la secreción sugiere que durante el proceso secretor, solo una parte del contenido vesicular puede salir de la célula, lo que solo podría ser posible si las vesículas secretoras establecieran temporalmente una continuidad con la membrana plasmática celular, expulsaran una parte de su contenido, luego se separaran y se volvieran a sellar.
La fusión transitoria de vesículas fue planteada por Katz y del Castillo en 1955. [ cita requerida ] Sin embargo, los primeros estudios sistemáticos fueron realizados por Ceccarelli et al. en 1973. Ceccarelli et al. estudiaron las uniones neuromusculares de la rana, estimulándolas con marcadores como la peroxidasa de rábano picante para identificar orgánulos endocitados, y utilizando protocolos de estimulación suave (2 Hz) o estimulación fuerte (10 Hz) durante períodos que iban desde 20 minutos a 4 horas. [1] [6] Con baja estimulación durante un período de 4 horas, Ceccarelli et al. encontraron que hubo un aumento en las vesículas marcadas con peroxidasa de rábano picante con el tiempo, y ningún aumento en los orgánulos grandes, lo que indica que las vesículas se fusionan rápidamente con la membrana presináptica y luego se separan de ella después de liberar sus neurotransmisores. [1] Plantearon la hipótesis de que, a bajas frecuencias de estimulación, la mayoría de las vesículas se reconstituyen rápidamente a partir de la membrana presináptica durante y después de la estimulación. [1] Estudios posteriores en el laboratorio de Ceccarelli acumularon evidencia sobre la hipótesis de la fusión transitoria al comparar datos electrofisiológicos y morfológicos. En particular, se examinaron imágenes de fusiones de vesículas en membranas presinápticas fracturadas por congelación y en imágenes de microscopio electrónico obtenidas de terminales congeladas rápidamente unos pocos ms después de la administración de una única descarga al nervio. [7] En 1993, Alvarez de Toledo y colegas demostraron directamente la ocurrencia de liberación de producto secretor durante la apertura momentánea de una vesícula que se fusiona transitoriamente, al combinar la medición de la capacitancia de la membrana (que monitorea los cambios en el área de superficie) con la detección amperométrica de la liberación de mediadores. [4] Esto llevó a Fesce et al. [2] a recapitular toda la evidencia indirecta a favor de la fusión transitoria y acuñar el término "beso y fuga". La evidencia más convincente de la fusión transitoria o de beso y fuga proviene del descubrimiento del porosoma , [8] una estructura lipoproteica permanente en forma de copa en la membrana plasmática de la célula, donde las vesículas secretoras se acoplan y fusionan transitoriamente para liberar el contenido intravesicular de la célula.
Tras el descubrimiento del mecanismo de beso y fuga por parte de Ceccarelli et al., se han realizado muchos estudios posteriores que aportan pruebas que respaldan la fusión de beso y fuga. Todos los estudios han sugerido que existen dos ventajas principales que tiene la fusión de beso y fuga sobre la fusión completa: 1) el beso y fuga permite un reciclado más eficiente de las vesículas y 2) el beso y fuga puede limitar la cantidad de neurotransmisores que se liberan debido a un poro de fusión más pequeño y un tiempo más corto durante el cual los neurotransmisores pueden liberarse realmente. Uno de los principales problemas de las pruebas del beso y fuga, y posteriormente la base de muchos contraargumentos en contra del beso y fuga, es que debido a que la fusión es tan corta, es muy difícil capturar un evento de beso y fuga real. [9] Sin embargo, la acumulación de vesículas parcialmente vacías después de la secreción favorece fuertemente el mecanismo de beso y fuga, lo que sugiere que durante el proceso secretor, solo una parte del contenido vesicular puede salir de la célula, lo que solo podría ser posible si las vesículas secretoras establecieran temporalmente una continuidad con la membrana plasmática celular, expulsaran una parte de su contenido, luego se desprendieran y volvieran a sellarse. Dado que los porosomas son estructuras permanentes en la membrana plasmática celular que miden solo una fracción del tamaño de la vesícula secretora, esto demuestra que las vesículas secretoras se acoplan "transitoriamente" y establecen una continuidad, en lugar de colapsar por completo.
Las células beta pancreáticas de rata liberan neurotransmisores a través de la fusión de beso y fuga. En las células endocrinas y neuroendocrinas , las vesículas similares a sinápticas (SLV) experimentan beso y fuga, pero ha sido controvertido si las vesículas grandes de núcleo denso (LDCV) también experimentan beso y fuga. [10] Los estudios han demostrado que las LDCV experimentan exocitosis de beso y fuga. [10] [11] MacDonald et al. utilizaron múltiples enfoques para probar la exocitosis de beso y fuga en células beta de rata. Al monitorear parches de membrana de células beta de rata intactas en presencia de 10 mM de glucosa y 5 mM de forskolina , MacDonald et al. encontraron que algunas vesículas experimentaron beso y fuga, como se vio por un evento exocitótico seguido de un evento endocitótico de una magnitud similar. [10] Los eventos de beso y fuga representaron el 25% de la exocitosis de LDCV y el 28% de la exocitosis de SLV. [10] Mientras que el beso y fuga de LDCV ocurrió el 25% del tiempo en presencia de forskolina, en ausencia de forskolina, la fusión de beso y fuga de LDCV ocurrió solo el 7% del tiempo. [10] Debido a que la forskolina aumenta los niveles de AMP cíclico (cAMP), el cAMP aparentemente juega un papel muy importante en el mecanismo de la fusión de beso y fuga de LDCV en las células beta pancreáticas de rata.
Se ha demostrado que los poros de fusión SLV (diámetro de poro: 0,8 +/- 0,1 nm) y LDCV (diámetro de poro: 1,4 +/- 0,1 nm) durante el beso y fuga son lo suficientemente grandes como para permitir el eflujo de ácido gamma-aminobutírico (GABA) y trifosfato de adenosina (ATP), pero son demasiado pequeños para liberar insulina en las células beta pancreáticas de rata. [10] Por lo tanto, el mecanismo de beso y fuga podría estar implicado en complicaciones médicas que involucran insulina.
Se ha demostrado que la exocitosis de beso y fuga ocurre en las sinapsis de las neuronas ubicadas en el hipocampo . Los estudios que utilizan FM1-43, un colorante anfifílico insertado en las vesículas o la membrana como marcador, han sido fundamentales para apoyar el beso y fuga en las sinapsis del hipocampo. En las sinapsis del hipocampo, se ha demostrado que las vesículas permiten la liberación normal de glutamato , un neurotransmisor excitatorio en el cerebro, sin permitir que el colorante FM1-43 entre o escape de la vesícula, lo que indica un mecanismo transitorio sugestivo de beso y fuga. [12] También se ha demostrado que los aumentos en la osmolaridad permiten una menor liberación de colorante en las sinapsis del hipocampo. En diversas soluciones hipertónicas, se liberó un 70% más de colorante FM1-43 de las vesículas estimuladas en 0,5 osM que de las vesículas estimuladas en 1,5 osM. [12] Por lo tanto, las vesículas ubicadas en regiones hipertónicas del cuerpo podrían tener más probabilidades de experimentar un modo de exocitosis de tipo "beso y fuga".
Las mitocondrias demuestran una fusión de beso y fuga en el intercambio de materiales de la membrana interna . Los estudios que utilizan KFP fotoactivado con luz verde y fluorescencia roja dirigidos a la matriz mitocondrial y PAGFP fotoactivado con luz cian y fluorescencia verde en células de rata han mostrado interacciones en las que el KFP y el PAGFP se transfirieron de una mitocondria a otra mitocondria a través de una fusión transitoria, lo que sugiere un mecanismo de beso y fuga. [13] A diferencia de la fusión completa de mitocondrias, que resultó en un solo orgánulo, la fusión transitoria de beso y fuga de dos mitocondrias resultó en dos membranas distintas. [13]
La manipulación del gen de atrofia óptica 1 (Opa1) tuvo efectos interesantes en la fusión entre mitocondrias. El silenciamiento del gen Opa1 disminuyó la actividad de fusión completa de las mitocondrias después de 24 horas, y la actividad de fusión completa se eliminó por completo después de que el gen Opa1 se silenció durante 48 horas. [13] La actividad de fusión transitoria de beso y fuga se mantuvo igual después de 24 horas de silenciamiento de Opa1. [13] La fusión de beso y fuga es más común con niveles bajos de expresión del gen Opa1 y niveles extremadamente altos de expresión del gen Opa1. Como resultado, la expresión de Opa1 gobierna la fusión en las mitocondrias con respecto al beso y fuga.
La fusión de beso y fuga en las mitocondrias ayuda a mantenerlas en un estado de motilidad reducida durante un período de tiempo más corto en comparación con la fusión completa. Liu et al. probaron tanto la fusión de beso y fuga como la fusión completa y sus efectos sobre la motilidad mitocondrial, y descubrieron que ambas formas de fusión resultaron en una disminución de la motilidad mitocondrial al principio, pero la fusión de beso y fuga restableció, e incluso aumentó, la motilidad mitocondrial inmediatamente después de que el evento de beso y fuga terminó. [13] La fusión de beso y fuga proporciona un mejor mecanismo para controlar la bioenergética mitocondrial que la fusión completa.
Se ha pensado que la fusión de beso y fuga se estabiliza mediante un recubrimiento de actina de las vesículas. Al probar la captación de FM1-43 por parte de las vesículas para observar cuándo se fusionaban con la membrana, los investigadores notaron que el recubrimiento de actina es un paso necesario para el mecanismo de beso y fuga. Las vesículas marcadas con la proteína fluorescente verde beta-actina (GFP) fluorescieron segundos después de fusionarse con la membrana presináptica (como lo muestra la captación de FM1-43), pero las vesículas no fusionadas nunca fluorescieron, lo que sugiere que se requiere un recubrimiento de actina para el mecanismo de beso y fuga. [14] Este recubrimiento de actina proviene de la polimerización de monómeros de actina.
El proceso de recubrimiento de actina necesario para la fusión transitoria de beso y fuga está mediado por calcio. El recubrimiento de actina de las vesículas fue inhibido por BAPTA-AM, que elimina el calcio. Con la ausencia de calcio mediante el uso de BAPTA-AM, todas las vesículas fusionadas permanecieron adheridas a la membrana presináptica pero no liberaron sus neurotransmisores, lo que sugiere que el calcio es necesario para formar el recubrimiento de actina y que el recubrimiento de actina es responsable del mecanismo de descarga o liberación de vesículas. [14]
La exocitosis de beso y fuga está regulada por la miosina II. Los estudios realizados con microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) en células neuroendocrinas PC12 mostraron que la miosina II regula la dinámica del poro de fusión durante la exocitosis de beso y fuga. [15] La sobreexpresión de la cadena ligera reguladora (RLC) de miosina II normal en tejido marcado con mRFP (proteína fluorescente roja monomérica) y tejido cerebral marcado con Venus resultó en una cinética de liberación prolongada, mientras que la sobreexpresión de una forma mutante de RLC de miosina II corta acortó la cinética de liberación. [15] La cinética de liberación prolongada es indicativa de un cierre más lento del poro de fusión, por lo que la miosina II también regula la cantidad de neurotransmisor que se libera durante la exocitosis de beso y fuga.
Existe un gran debate académico sobre el papel de las proteínas SNARE en la exocitosis de beso y fuga. Las proteínas SNARE median la fusión de vesículas (la exocitosis de vesículas con la membrana presináptica en el poro de fusión). Cuando una vesícula se fusiona con la membrana presináptica, se produce una transición SNARE de una posición trans a una posición cis , seguida de una disociación SNARE. [16] Se pensaba que este proceso era irreversible. Sin embargo, si se produce una exocitosis de beso y fuga, esto sugeriría que se produce una asociación reversible de las proteínas SNARE y media el modo de exocitosis de beso y fuga. [16] La manipulación de las proteínas SNARE durante el beso y fuga puede proporcionar más información sobre cómo se relacionan ambos, y se requiere más investigación académica.