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Splicing alternativo

El empalme alternativo produce tres isoformas de proteínas . La proteína A incluye todos los exones, mientras que las proteínas B y C resultan de la omisión de exones .

El empalme alternativo , o empalme alternativo de ARN , o empalme diferencial , es un proceso de empalme alternativo durante la expresión génica que permite que un solo gen codifique múltiples proteínas . En este proceso, exones particulares de un gen pueden incluirse o excluirse del ARN mensajero (ARNm) procesado final producido a partir de ese gen. [1] Esto significa que los exones se unen en diferentes combinaciones, lo que da lugar a diferentes cadenas de ARNm (alternativas). En consecuencia, las proteínas traducidas a partir de ARNm empalmados alternativamente suelen contener diferencias en su secuencia de aminoácidos y, a menudo, en sus funciones biológicas (ver Figura).

El empalme alternativo biológicamente relevante ocurre como un fenómeno normal en eucariotas , donde aumenta la cantidad de proteínas que pueden ser codificadas por el genoma. [1] En humanos, se cree ampliamente que ~95% de los genes multiexónicos se empalman alternativamente para producir productos alternativos funcionales a partir del mismo gen [2] pero muchos científicos creen que la mayoría de las variantes de empalme observadas se deben a errores de empalme. y el número real de genes biológicamente relevantes empalmados alternativamente es mucho menor. [3] [4]

El empalme alternativo permite la generación regulada de múltiples ARNm y productos proteicos a partir de un solo gen. [5]

Se observan numerosos modos de empalme alternativo, de los cuales el más común es la omisión de exones . De este modo, un exón particular puede incluirse en los ARNm en algunas condiciones o en tejidos concretos, y omitirse del ARNm en otras. [1]

La producción de ARNm empalmados alternativamente está regulada por un sistema de proteínas de acción trans que se unen a sitios de acción cis en el propio transcrito primario . Dichas proteínas incluyen activadores de empalme que promueven el uso de un sitio de empalme particular y represores de empalme que reducen el uso de un sitio particular. Los mecanismos de empalme alternativo son muy variables y constantemente se encuentran nuevos ejemplos, particularmente mediante el uso de técnicas de alto rendimiento. Los investigadores esperan dilucidar completamente los sistemas reguladores involucrados en el empalme, de modo que los productos de empalme alternativos de un gen determinado en condiciones particulares ("variantes de empalme") puedan predecirse mediante un "código de empalme". [6] [7]

Las variaciones anormales en el empalme también están implicadas en la enfermedad ; una gran proporción de los trastornos genéticos humanos son el resultado de variantes de empalme. [6] También se cree que las variantes de empalme anormales contribuyen al desarrollo del cáncer, [8] [9] [10] [11] y los genes del factor de empalme frecuentemente están mutados en diferentes tipos de cáncer. [11]

Descubrimiento

El empalme alternativo se observó por primera vez en 1977. [12] [13] El adenovirus produce cinco transcritos primarios al principio de su ciclo infeccioso, antes de la replicación del ADN viral, y uno adicional más tarde, después de que comienza la replicación del ADN. Los primeros transcritos primarios continúan produciéndose después de que comienza la replicación del ADN. La transcripción primaria adicional producida al final de la infección es grande y proviene de 5/6 del genoma del adenovirus de 32 kb. Esto es mucho más grande que cualquiera de los ARNm de adenovirus individuales presentes en las células infectadas. Los investigadores descubrieron que el transcrito de ARN primario producido por el adenovirus tipo 2 en la fase tardía se empalmaba de muchas maneras diferentes, lo que daba como resultado ARNm que codificaban diferentes proteínas virales. Además, el transcrito primario contenía múltiples sitios de poliadenilación , dando diferentes extremos 3' para los ARNm procesados. [14] [15] [16]

En 1981, se caracterizó el primer ejemplo de empalme alternativo en una transcripción de un gen endógeno normal . [14] Se descubrió que el gen que codifica la hormona tiroidea calcitonina está empalmado alternativamente en células de mamíferos. La transcripción primaria de este gen contiene 6 exones; el ARNm de calcitonina contiene los exones 1 a 4 y termina después de un sitio de poliadenilación en el exón 4. Se produce otro ARNm a partir de este pre-ARNm omitiendo el exón 4 e incluye los exones 1 a 3, 5 y 6. Codifica una proteína conocida como CGRP ( péptido relacionado con el gen de la calcitonina ). [17] [18] A principios de la década de 1980 también se observaron ejemplos de empalme alternativo en transcripciones de genes de inmunoglobina en mamíferos. [14] [19]

Desde entonces, se han encontrado muchos otros ejemplos de empalme alternativo biológicamente relevante en eucariotas. [1] El "poseedor del récord" de empalme alternativo es un gen de D. melanogaster llamado Dscam , que podría tener potencialmente 38.016 variantes de empalme. [20]

En 2021, se descubrió que el genoma del adenovirus tipo 2, el adenovirus en el que se identificó por primera vez el empalme alternativo, era capaz de producir una variedad de ARNm mucho mayor de lo que se pensaba anteriormente. [21] Mediante el uso de tecnología de secuenciación de próxima generación, los investigadores pudieron actualizar el transcriptoma del adenovirus humano tipo 2 y presentar un alucinante 904 ARNm único, producido por el virus a través de un patrón complejo de empalme alternativo. Se ha demostrado que muy pocas de estas variantes de empalme son funcionales, un punto que los autores plantean en su artículo.

"Una pregunta pendiente es qué papel desempeña la colección de nuevos ARN o si son moléculas espurias generadas por una maquinaria de empalme sobrecargada". [21]

Modos

Clasificación tradicional de tipos básicos de eventos de empalme de ARN alternativos. Los exones se representan como bloques azules y amarillos, los intrones como líneas intermedias.
Las frecuencias relativas de los tipos de eventos de empalme alternativo difieren entre humanos y moscas de la fruta. [22]

Generalmente se reconocen cinco modos básicos de empalme alternativo. [1] [2] [6] [22]

Además de estos modos primarios de empalme alternativo, existen otros dos mecanismos principales mediante los cuales se pueden generar diferentes ARNm a partir del mismo gen; múltiples promotores y múltiples sitios de poliadenilación . El uso de múltiples promotores se describe adecuadamente como un mecanismo de regulación transcripcional en lugar de un empalme alternativo; Al iniciar la transcripción en diferentes puntos, se pueden generar transcripciones con diferentes exones en el extremo 5'. En el otro extremo, múltiples sitios de poliadenilación proporcionan diferentes puntos finales 3' para la transcripción. Ambos mecanismos se encuentran en combinación con el empalme alternativo y proporcionan variedad adicional en los ARNm derivados de un gen. [dieciséis ]

Corte esquemático de tres estructuras de empalme en el gen de la hialuronidasa murina . La direccionalidad de la transcripción de 5' a 3' se muestra de izquierda a derecha. Los exones e intrones no están dibujados a escala.


Estos modos describen mecanismos de empalme básicos, pero pueden ser inadecuados para describir eventos de empalme complejos. Por ejemplo, la figura de la derecha muestra 3 formas de empalme del gen de la hialuronidasa 3 de ratón. La comparación de la estructura exónica que se muestra en la primera línea (verde) con la de la segunda línea (amarilla) muestra retención de intrones, mientras que la comparación entre la segunda y la tercera forma de empalme (amarilla frente a azul) muestra omisión de exones. Recientemente se ha propuesto una nomenclatura modelo para designar de forma única todos los patrones de empalme posibles. [22]

Mecanismos

Mecanismo de empalme general

El complejo Spliceosoma A define los extremos 5' y 3' del intrón antes de su eliminación [6]

Cuando el pre-ARNm ha sido transcrito a partir del ADN , incluye varios intrones y exones . (En los nematodos , la media es de 4 a 5 exones e intrones; en la mosca de la fruta Drosophila puede haber más de 100 intrones y exones en un pre-ARNm transcrito). Los exones que se retendrán en el ARNm se determinan durante el proceso de empalme. . La regulación y selección de los sitios de empalme se realizan mediante proteínas activadoras de empalme que actúan en trans y proteínas represoras de empalme, así como elementos que actúan en cis dentro del propio pre-ARNm, como potenciadores de empalme exónico y silenciadores de empalme exónico.

El intrón nuclear eucariota típico tiene secuencias consenso que definen regiones importantes. Cada intrón tiene la secuencia GU en su extremo 5'. Cerca del extremo 3' hay una sucursal. El nucleótido en el punto de ramificación es siempre una A; El consenso en torno a esta secuencia varía un poco. En humanos, la secuencia consenso del sitio de ramificación es yUnAy. [24] El sitio de ramificación es seguido por una serie de pirimidinas (el tracto de polipirimidina ) y luego por AG en el extremo 3'. [6]

El empalme del ARNm se realiza mediante un complejo de ARN y proteínas conocido como espliceosoma , que contiene snRNP denominados U1, U2 , U4, U5 y U6 (U3 no participa en el empalme del ARNm). [25] U1 se une al 5' GU y U2, con la ayuda de los factores proteicos U2AF , se une al punto de ramificación A dentro del sitio de la ramificación. El complejo en esta etapa se conoce como complejo de espliceosoma A. La formación del complejo A suele ser el paso clave para determinar los extremos del intrón que se van a cortar y definir los extremos del exón que se van a retener. [6] (La nomenclatura U deriva de su alto contenido en uridina).

El complejo U4, U5, U6 se une y U6 reemplaza la posición U1. U1 y U4 se van. El complejo restante luego realiza dos reacciones de transesterificación . En la primera transesterificación, el extremo 5' del intrón se escinde del exón aguas arriba y se une al sitio de ramificación A mediante un enlace fosfodiéster 2',5' . En la segunda transesterificación, el extremo 3' del intrón se escinde del exón aguas abajo y los dos exones se unen mediante un enlace fosfodiéster. Luego, el intrón se libera en forma de lazo y se degrada. [1]

Elementos reguladores y proteínas.

Empalmando la represión

El empalme está regulado por proteínas que actúan en trans (represores y activadores) y los correspondientes sitios reguladores que actúan en cis (silenciadores y potenciadores) en el pre-ARNm. Sin embargo, como parte de la complejidad del empalme alternativo, se observa que los efectos de un factor de empalme frecuentemente dependen de la posición. Es decir, un factor de empalme que sirve como activador de empalme cuando se une a un elemento potenciador intrónico puede servir como represor cuando se une a su elemento de empalme en el contexto de un exón, y viceversa. [26] La estructura secundaria de la transcripción de pre-ARNm también desempeña un papel en la regulación del empalme, como al reunir elementos de empalme o enmascarar una secuencia que de otro modo serviría como elemento de unión para un factor de empalme. [27] [28] Juntos, estos elementos forman un "código de empalme" que gobierna cómo se producirá el empalme en diferentes condiciones celulares. [29] [30]

Hay dos tipos principales de elementos de secuencia de ARN que actúan en cis presentes en los pre-ARNm y tienen sus correspondientes proteínas de unión a ARN que actúan en trans . Los silenciadores de empalme son sitios a los que se unen las proteínas represoras de empalme, lo que reduce la probabilidad de que un sitio cercano se utilice como unión de empalme. Estos pueden estar ubicados en el propio intrón (intronic splicing silenciadores, ISS) o en un exón vecino ( exonic splicing silenciadores , ESS). Varían en secuencia, así como en los tipos de proteínas que se unen a ellos. La mayoría de los represores de empalme son ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP), como hnRNPA1 y la proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB). [6] [29] Los potenciadores de empalme son sitios a los que se unen las proteínas activadoras de empalme, lo que aumenta la probabilidad de que un sitio cercano se utilice como unión de empalme. Estos también pueden ocurrir en el intrón (potenciadores de empalme intrónico, ISE) o en el exón ( potenciadores de empalme exónico , ESE). La mayoría de las proteínas activadoras que se unen a ISE y ESE son miembros de la familia de proteínas SR . Estas proteínas contienen motivos de reconocimiento de ARN y dominios ricos en arginina y serina (RS). [6] [29]

Activación de empalme

En general, los determinantes del empalme funcionan de una manera interdependiente que depende del contexto, de modo que las reglas que rigen cómo se regula el empalme forman un código de empalme. [30] La presencia de un elemento de secuencia de ARN que actúa en cis en particular puede aumentar la probabilidad de que un sitio cercano se empalme en algunos casos, pero disminuir la probabilidad en otros casos, dependiendo del contexto. El contexto dentro del cual actúan los elementos reguladores incluye el contexto de acción cis que se establece por la presencia de otras características de la secuencia de ARN y el contexto de acción trans que se establece por las condiciones celulares. Por ejemplo, algunos elementos de la secuencia de ARN que actúan en cis influyen en el empalme sólo si hay múltiples elementos presentes en la misma región para establecer el contexto. Como otro ejemplo, un elemento que actúa en cis puede tener efectos opuestos sobre el empalme, dependiendo de qué proteínas se expresen en la célula (por ejemplo, PTB neuronal versus no neuronal). La importancia adaptativa del empalme de silenciadores y potenciadores está atestiguada por estudios que muestran que existe una fuerte selección en los genes humanos contra mutaciones que producen nuevos silenciadores o alteran los potenciadores existentes. [31] [32]

Metilación del ADN y empalme alternativo en insectos sociales.

La metilación del ADN CpG ha demostrado un papel en la regulación del empalme alternativo en insectos sociales. [33] [34] En las abejas melíferas ( Apis mellifera ), la metilación del ADN CpG parece regular la omisión de exones según los primeros estudios genómicos [35] [36] después de que el genoma de las abejas estuvo disponible. [37] La ​​metilación del ADN CpG regula el empalme alternativo de manera más extensa, no solo afecta la omisión de exones, sino también la retención de intrones y otros eventos de empalme. [38]

Ejemplos

Salto de exón: Drosophila dsx

Empalme alternativo de pre-ARNm de dsx

Los pre-ARNm del gen dsx de D. melanogaster contienen 6 exones. En los machos, los exones 1,2,3,5 y 6 se unen para formar el ARNm, que codifica una proteína reguladora transcripcional necesaria para el desarrollo masculino. En las mujeres, los exones 1, 2, 3 y 4 están unidos y una señal de poliadenilación en el exón 4 provoca la escisión del ARNm en ese punto. El ARNm resultante es una proteína reguladora transcripcional necesaria para el desarrollo femenino. [39]

Este es un ejemplo de omisión de exones. El intrón aguas arriba del exón 4 tiene un tracto de polipirimidina que no coincide bien con la secuencia consenso , de modo que las proteínas U2AF se unen mal a él sin la ayuda de activadores de empalme. Por lo tanto, este sitio aceptor de empalme 3' no se utiliza en machos. Las hembras, sin embargo, producen el transformador activador de empalme (Tra) (ver más abajo). La proteína SR Tra2 se produce en ambos sexos y se une a un ESE en el exón 4; si Tra está presente, se une a Tra2 y, junto con otra proteína SR, forma un complejo que ayuda a las proteínas U2AF a unirse al tracto débil de polipirimidina. U2 se recluta en el punto de ramificación asociado y esto conduce a la inclusión del exón 4 en el ARNm. [39] [40]

Sitios aceptores alternativos: Drosophila Transformador

Empalme alternativo del producto del gen Transformer de Drosophila .

Los pre-ARNm del gen Transformer (Tra) de Drosophila melanogaster se someten a un corte y empalme alternativo a través del modo de sitio aceptor alternativo. El gen Tra codifica una proteína que se expresa sólo en mujeres. La transcripción primaria de este gen contiene un intrón con dos posibles sitios aceptores. En los machos, se utiliza el sitio aceptor aguas arriba. Esto hace que se incluya una versión más larga del exón 2 en la transcripción procesada, incluido un codón de parada temprano . El ARNm resultante codifica un producto proteico truncado que está inactivo. Las hembras producen la proteína maestra para la determinación del sexo Sex letal (Sxl). La proteína Sxl es un represor de empalme que se une a una ISS en el ARN del transcrito Tra cerca del sitio aceptor aguas arriba, evitando que la proteína U2AF se una al tracto de polipirimidina. Esto impide el uso de esta unión, desplazando la unión del espliceosoma al sitio aceptor aguas abajo. El empalme en este punto pasa por alto el codón de parada, que se elimina como parte del intrón. El ARNm resultante codifica una proteína Tra activa, que a su vez es un regulador del corte y empalme alternativo de otros genes relacionados con el sexo (ver dsx arriba). [1]

Definición de exón: receptor Fas

Empalme alternativo del pre-ARNm del receptor Fas

Se producen múltiples isoformas de la proteína del receptor Fas mediante empalme alternativo. Dos isoformas que ocurren normalmente en humanos se producen mediante un mecanismo de omisión de exones. Un ARNm que incluye el exón 6 codifica la forma unida a la membrana del receptor Fas, que promueve la apoptosis o muerte celular programada. El aumento de la expresión del receptor Fas en las células de la piel expuestas crónicamente al sol y la ausencia de expresión en las células cancerosas de la piel sugiere que este mecanismo puede ser importante en la eliminación de células precancerosas en humanos. [41] Si se omite el exón 6, el ARNm resultante codifica una proteína Fas soluble que no promueve la apoptosis. La inclusión u omisión del exón depende de dos proteínas antagonistas, TIA-1 y la proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB).

Este mecanismo es un ejemplo de definición de exón en el empalme. Un espliceosoma se ensambla en un intrón y las subunidades snRNP pliegan el ARN de modo que los extremos 5' y 3' del intrón queden unidos. Sin embargo, ejemplos recientemente estudiados como este muestran que también existen interacciones entre los extremos del exón. En este caso particular, estas interacciones de definición de exón son necesarias para permitir la unión de los factores de empalme centrales antes del ensamblaje de los espliceosomas en los dos intrones flanqueantes. [42]

Competencia represor-activador: VIH-1 tat exón 2

Empalme alternativo del exón 2 tat del VIH-1

El VIH , el retrovirus que causa el SIDA en humanos, produce una única transcripción de ARN primario, que alternativamente se empalma de múltiples maneras para producir más de 40 ARNm diferentes. [43] El equilibrio entre transcripciones empalmadas diferencialmente proporciona múltiples ARNm que codifican diferentes productos que se requieren para la multiplicación viral. [44] Uno de los transcritos empalmados diferencialmente contiene el gen tat , en el cual el exón 2 es un exón en casete que puede omitirse o incluirse. La inclusión del exón 2 de tat en el ARN está regulada por la competencia entre el represor de empalme hnRNP A1 y la proteína SR SC35. Dentro del exón 2, se superponen una secuencia silenciadora de empalme exónico (ESS) y una secuencia potenciadora de empalme exónico (ESE). Si la proteína represora A1 se une al ESS, inicia la unión cooperativa de múltiples moléculas A1, extendiéndose hacia el sitio donante 5' aguas arriba del exón 2 y evitando la unión del factor de empalme central U2AF35 al tracto de polipirimidina. Si SC35 se une al ESE, evita la unión de A1 y mantiene el sitio donante 5' en un estado accesible para el ensamblaje del espliceosoma. La competencia entre el activador y el represor asegura que se produzcan ambos tipos de ARNm (con y sin exón 2). [43]

Significado adaptativo

El empalme alternativo genuino ocurre tanto en genes codificadores de proteínas como en genes no codificantes para producir múltiples productos (proteínas o ARN no codificantes). Se necesita información externa para decidir qué producto se fabrica, dada una secuencia de ADN y la transcripción inicial. Dado que los métodos de regulación se heredan, esto proporciona nuevas formas para que las mutaciones afecten la expresión genética. [10]

El empalme alternativo puede proporcionar flexibilidad evolutiva. Una mutación puntual única puede provocar que un exón determinado se excluya o incluya ocasionalmente de una transcripción durante el corte y empalme, lo que permite la producción de una nueva isoforma proteica sin pérdida de la proteína original. [1] Los estudios han identificado regiones intrínsecamente desordenadas (ver Proteínas intrínsecamente no estructuradas ) enriquecidas en exones no constitutivos [45], lo que sugiere que las isoformas de proteínas pueden mostrar diversidad funcional debido a la alteración de los módulos funcionales dentro de estas regiones. Esta diversidad funcional lograda por las isoformas se refleja en sus patrones de expresión y puede predecirse mediante enfoques de aprendizaje automático. [46] [47] Los estudios comparativos indican que el empalme alternativo precedió a la multicelularidad en la evolución y sugieren que este mecanismo podría haber sido cooptado para ayudar en el desarrollo de organismos multicelulares. [48]

La investigación basada en el Proyecto Genoma Humano y otras secuenciaciones del genoma ha demostrado que los humanos tienen sólo alrededor de un 30% más de genes que el gusano redondo Caenorhabditis elegans , y sólo aproximadamente el doble que la mosca Drosophila melanogaster . Este hallazgo llevó a la especulación de que la mayor complejidad percibida en los humanos, o en los vertebrados en general, podría deberse a tasas más altas de empalme alternativo en los humanos que las que se encuentran en los invertebrados. [49] [50] Sin embargo, un estudio sobre muestras de 100.000 etiquetas de secuencia expresadas (EST) de humanos, ratones, ratas, vacas, moscas ( D. melanogaster ), gusanos ( C. elegans ) y la planta Arabidopsis thaliana encontró No hay grandes diferencias en la frecuencia de genes empalmados alternativamente entre los humanos y cualquiera de los otros animales probados. [51] Otro estudio, sin embargo, propuso que estos resultados eran un artefacto de los diferentes números de tecnologías ecológicamente racionales disponibles para los diversos organismos. Cuando compararon frecuencias de empalme alternativo en subconjuntos aleatorios de genes de cada organismo, los autores concluyeron que los vertebrados tienen tasas de empalme alternativo más altas que los invertebrados. [52]

Enfermedad

Los cambios en la maquinaria de procesamiento del ARN pueden dar lugar a un mal empalme de múltiples transcripciones, mientras que las alteraciones de un solo nucleótido en los sitios de empalme o en los sitios reguladores de empalme que actúan en cis pueden provocar diferencias en el empalme de un único gen y, por tanto, en el ARNm producido a partir de un gen. transcripciones de genes mutantes. Un estudio realizado en 2005 que incluyó análisis probabilísticos indicó que más del 60% de las mutaciones que causan enfermedades humanas afectan el empalme en lugar de afectar directamente las secuencias codificantes. [53] Un estudio más reciente indica que es probable que un tercio de todas las enfermedades hereditarias tengan un componente de empalme. [26] Independientemente del porcentaje exacto, existen varias enfermedades relacionadas con el empalme. [54] Como se describe a continuación, un ejemplo destacado de enfermedades relacionadas con el empalme es el cáncer.

Los ARNm empalmados anormalmente también se encuentran en una alta proporción de células cancerosas. [8] [9] [11] Los análisis combinados de RNA-Seq y proteómica han revelado una sorprendente expresión diferencial de isoformas de empalme de proteínas clave en importantes vías del cáncer. [55] No siempre está claro si estos patrones aberrantes de empalme contribuyen al crecimiento canceroso o son simplemente consecuencia de anomalías celulares asociadas con el cáncer. Para ciertos tipos de cáncer, como el colorrectal y el de próstata, se ha demostrado que la cantidad de errores de empalme por cáncer varía mucho entre cánceres individuales, un fenómeno conocido como inestabilidad del transcriptoma . [56] [57] Se ha demostrado además que la inestabilidad del transcriptoma se correlaciona en gran medida con un nivel de expresión reducido de los genes del factor de empalme. Se ha demostrado que la mutación de DNMT3A contribuye a las neoplasias hematológicas y que las líneas celulares mutadas en DNMT3A exhiben inestabilidad del transcriptoma en comparación con sus contrapartes isogénicas de tipo salvaje. [58]

De hecho, en realidad hay una reducción del empalme alternativo en las células cancerosas en comparación con las normales, y los tipos de empalme difieren; por ejemplo, las células cancerosas muestran niveles más altos de retención de intrones que las células normales, pero niveles más bajos de omisión de exones. [59] Algunas de las diferencias en el empalme en células cancerosas pueden deberse a la alta frecuencia de mutaciones somáticas en los genes de los factores de empalme, [11] y algunas pueden resultar de cambios en la fosforilación de los factores de empalme que actúan en trans. [10] Otros pueden producirse por cambios en las cantidades relativas de factores de empalme producidos; por ejemplo, se ha demostrado que las células de cáncer de mama tienen niveles elevados del factor de empalme SF2/ASF . [60] Un estudio encontró que un porcentaje relativamente pequeño (383 de más de 26000) de variantes de empalme alternativo tenían una frecuencia significativamente mayor en las células tumorales que en las células normales, lo que sugiere que existe un conjunto limitado de genes que, cuando se empalman mal, contribuir al desarrollo de tumores. [61] Sin embargo, se cree que los efectos nocivos de las transcripciones mal empalmadas generalmente se salvaguardan y eliminan mediante un mecanismo de control de calidad postranscripcional celular denominado desintegración del ARNm mediada sin sentido [NMD]. [62]

Un ejemplo de una variante de empalme específica asociada con el cáncer se encuentra en uno de los genes DNMT humanos . Tres genes DNMT codifican enzimas que añaden grupos metilo al ADN, una modificación que a menudo tiene efectos reguladores. Varios ARNm de DNMT3B empalmados anormalmente se encuentran en tumores y líneas celulares cancerosas. En dos estudios separados, la expresión de dos de estos ARNm empalmados anormalmente en células de mamíferos provocó cambios en los patrones de metilación del ADN en esas células. Las células con uno de los ARNm anormales también crecieron dos veces más rápido que las células de control, lo que indica una contribución directa de este producto al desarrollo del tumor. [10]

Otro ejemplo es el protooncogén Ron ( MST1R ) . Una propiedad importante de las células cancerosas es su capacidad para moverse e invadir el tejido normal. Se ha descubierto que la producción de una transcripción de Ron empalmada anormalmente está asociada con niveles elevados de SF2/ASF en las células de cáncer de mama. La isoforma anormal de la proteína Ron codificada por este ARNm conduce a la motilidad celular . [60]

Se ha identificado la sobreexpresión de una variante de empalme truncada del gen FOSB ( ΔFosB ) en una población específica de neuronas en el núcleo accumbens como el mecanismo causal implicado en la inducción y el mantenimiento de la adicción a las drogas y las recompensas naturales . [63] [64] [65] [66]

Estudios provocativos recientes apuntan a una función clave de la estructura de la cromatina y las modificaciones de las histonas en la regulación del empalme alternativo. Estos conocimientos sugieren que la regulación epigenética determina no sólo qué partes del genoma se expresan sino también cómo se unen. [67]

Análisis a escala del genoma (todo el transcriptoma)

El análisis de todo el transcriptoma del empalme alternativo generalmente se realiza mediante secuenciación de ARN de alto rendimiento. Más comúnmente, mediante secuenciación de lectura corta, como mediante instrumentación Illumina. Pero aún más informativo, mediante secuenciación de lectura larga, como mediante instrumentación Nanopore o PacBio. Los análisis de todo el transcriptoma se pueden utilizar, por ejemplo, para medir la cantidad de empalme alternativo desviado, como en una cohorte de cáncer. [68]

Se han utilizado tecnologías de secuenciación profunda para realizar análisis de todo el genoma de ARNm procesados ​​y no procesados; proporcionando así información sobre empalmes alternativos. Por ejemplo, los resultados del uso de secuenciación profunda indican que, en humanos, aproximadamente el 95% de las transcripciones de genes multiexónicos se someten a un empalme alternativo, con una serie de transcripciones de pre-ARNm empalmadas de una manera específica del tejido. [2] También se han desarrollado genómica funcional y enfoques computacionales basados ​​en el aprendizaje de múltiples instancias para integrar datos de RNA-seq para predecir funciones para isoformas empalmadas alternativamente. [47] La ​​secuenciación profunda también ha ayudado en la detección in vivo de los lazos transitorios que se liberan durante el empalme, la determinación de secuencias de sitios de ramificación y el mapeo a gran escala de puntos de ramificación en transcripciones de pre-ARNm humano. [69]

Más históricamente, se han encontrado transcripciones empalmadas alternativamente comparando secuencias EST , pero esto requiere la secuenciación de un número muy grande de EST. La mayoría de las bibliotecas EST provienen de un número muy limitado de tejidos, por lo que es probable que en cualquier caso se pasen por alto variantes de empalme específicas de tejido. Sin embargo, se han desarrollado enfoques de alto rendimiento para investigar el empalme, como: análisis basados ​​en microarrays de ADN , ensayos de unión de ARN y secuenciación profunda . Estos métodos se pueden utilizar para detectar polimorfismos o mutaciones en o alrededor de elementos de empalme que afectan la unión de proteínas. Cuando se combinan con ensayos de empalme, incluidos ensayos de genes indicadores in vivo , se pueden analizar los efectos funcionales de los polimorfismos o mutaciones en el empalme de transcripciones de pre-ARNm. [26] [29] [70]

En el análisis de micromatrices, se han utilizado matrices de fragmentos de ADN que representan exones individuales ( por ejemplo, micromatriz de exones de Affymetrix ) o límites exón/exón ( por ejemplo, matrices de ExonHit o Jivan ). Luego se sonda la matriz con ADNc marcado de tejidos de interés. Los ADNc de la sonda se unen al ADN de los exones que están incluidos en los ARNm en su tejido de origen, o al ADN del límite donde se han unido dos exones. Esto puede revelar la presencia de ARNm particulares empalmados alternativamente. [71]

CLIP ( reticulación e inmunoprecipitación ) utiliza radiación ultravioleta para unir proteínas a moléculas de ARN en un tejido durante el empalme. Luego se precipita una proteína reguladora de empalme de interés que actúa en trans utilizando anticuerpos específicos. Cuando el ARN unido a esa proteína se aísla y se clona, ​​se revelan las secuencias objetivo de esa proteína. [7] Otro método para identificar proteínas de unión a ARN y mapear su unión a transcripciones de pre-ARNm es la "Evaluación de microarrays de aptámeros genómicos por turno (MEGAshift)".net [ 72] Este método implica una adaptación de la "Evolución sistemática de ligandos por el método Exponential Enrichment (SELEX)" [73] junto con una lectura basada en microarrays. El uso del método MEGAshift ha proporcionado información sobre la regulación del empalme alternativo al permitir la identificación de secuencias en transcripciones de pre-ARNm que rodean exones empalmados alternativamente que median la unión a diferentes factores de empalme, como ASF/SF2 y PTB. [74] Este enfoque también se ha utilizado para ayudar a determinar la relación entre la estructura secundaria del ARN y la unión de los factores de empalme. [28]

El uso de ensayos indicadores hace posible encontrar las proteínas de corte y empalme involucradas en un evento de corte y empalme alternativo específico mediante la construcción de genes indicadores que expresarán una de dos proteínas fluorescentes diferentes dependiendo de la reacción de corte y empalme que se produzca. Este método se ha utilizado para aislar mutantes que afectan el empalme y así identificar nuevas proteínas reguladoras del empalme inactivadas en esos mutantes. [7]

Los avances recientes en la predicción de la estructura de proteínas han facilitado el desarrollo de nuevas herramientas para la anotación del genoma y el análisis de empalme alternativo. Por ejemplo, isoform.io, una plataforma guiada por predicciones de estructuras de proteínas, ha evaluado cientos de miles de isoformas de genes codificadores de proteínas humanas ensamblados a partir de numerosos experimentos de secuenciación de ARN en una variedad de tejidos humanos. Este análisis exhaustivo ha llevado a la identificación de numerosas isoformas con una estructura predicha con mayor confianza y una función potencialmente superior en comparación con las isoformas canónicas en la última base de datos de genes humanos. Al integrar predicciones estructurales con expresión y evidencia evolutiva, este enfoque ha demostrado el potencial de la predicción de la estructura de las proteínas como herramienta para refinar la anotación del genoma humano. [75]

Bases de datos

Existe una colección de bases de datos de empalme alternativas. [76] [77] [78] Estas bases de datos son útiles para encontrar genes que tengan pre-ARNm sometidos a empalmes alternativos y eventos de empalme alternativos o para estudiar el impacto funcional del empalme alternativo.

Ver también

Referencias

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  65. ^ Biliński P, Wojtyła A, Kapka-Skrzypczak L, Chwedorowicz R, Cyranka M, Studziński T (2012). "Regulación epigenética en la drogadicción". Anales de Medicina Agrícola y Ambiental . 19 (3): 491–6. PMID  23020045. Por estos motivos, ΔFosB se considera un factor de transcripción primario y causante en la creación de nuevas conexiones neuronales en el centro de recompensa, la corteza prefrontal y otras regiones del sistema límbico. Esto se refleja en el nivel aumentado, estable y duradero de sensibilidad a la cocaína y otras drogas, y en la tendencia a recaer incluso después de largos períodos de abstinencia. Estas redes recién construidas funcionan de manera muy eficiente a través de nuevas vías tan pronto como se siguen consumiendo drogas de abuso.
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enlaces externos

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