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Efector similar al activador de la transcripción

Los efectores TAL ( similares a activadores de la transcripción ) (a menudo denominados TALE , pero que no deben confundirse con la clase de proteínas homeobox de extensión de bucle de tres aminoácidos) son proteínas secretadas por algunas proteobacterias β y γ . [ 1 ] La mayoría de estas son Xanthomonas . Las bacterias fitopatógenas Xanthomonas son especialmente conocidas por los TALE, producidos a través de su sistema de secreción de tipo III . Estas proteínas pueden unirse a secuencias promotoras en la planta huésped y activar la expresión de genes vegetales que ayudan a la infección bacteriana. Se sabe que el dominio TALE responsable de la unión al ADN tiene entre 1,5 y 33,5 secuencias cortas que se repiten varias veces (repeticiones en tándem). [2] Se descubrió que cada una de estas repeticiones era específica para un determinado par de bases del ADN. [2] Estas repeticiones también tienen residuos variables de repetición (RVD) que pueden detectar pares de bases de ADN específicos. [2] Reconocen secuencias de ADN de plantas a través de un dominio de repetición central que consiste en un número variable de repeticiones de ~34 aminoácidos. Parece haber una correspondencia uno a uno entre la identidad de dos aminoácidos críticos en cada repetición y cada base de ADN en la secuencia objetivo. Estas proteínas son interesantes para los investigadores tanto por su papel en la enfermedad de especies de cultivos importantes como por la relativa facilidad de redireccionarlas para que se unan a nuevas secuencias de ADN. Se pueden encontrar proteínas similares en la bacteria patógena Ralstonia solanacearum [3] [4] [1] y Burkholderia rhizoxinica , [5] [1] así como en microorganismos marinos aún no identificados. [6] El término TALE-likes se utiliza para referirse a la supuesta familia de proteínas que abarca las TALE y estas proteínas relacionadas.

Función en la patogénesis de las plantas

Xantomonas

Las Xanthomonas son bacterias Gram-negativas que pueden infectar una amplia variedad de especies de plantas, incluyendo pimientos, arroz, cítricos, algodón, tomates y soja. [7] Algunos tipos de Xanthomonas causan manchas o rayas foliares localizadas, mientras que otras se propagan sistémicamente y causan podredumbre negra o tizón de las hojas. Inyectan una serie de proteínas efectoras, incluyendo efectores TAL, en la planta a través de su sistema de secreción de tipo III . Los efectores TAL tienen varios motivos normalmente asociados con eucariotas, incluyendo múltiples señales de localización nuclear y un dominio de activación ácida. Cuando se inyectan en plantas, estas proteínas pueden entrar en el núcleo de la célula vegetal, unirse a secuencias promotoras de la planta y activar la transcripción de genes vegetales que ayudan en la infección bacteriana. [7] Las plantas han desarrollado un mecanismo de defensa contra los efectores de tipo III que incluye genes R (resistencia) activados por estos efectores. Algunos de estos genes R parecen haber evolucionado para contener sitios de unión TAL-efector similares al sitio en el gen objetivo previsto. Se ha planteado la hipótesis de que esta competencia entre las bacterias patógenas y la planta huésped explica la naturaleza aparentemente maleable del dominio de unión al ADN del efector TAL. [8]

No-Xantomonas

R. solanacearum , B. rhizoxinica y la enfermedad de la sangre del banano (una bacteria aún no identificada definitivamente, en el grupo de especies R. solanacearum ). [1]

Reconocimiento de ADN

La característica más distintiva de los efectores TAL es un dominio de repetición central que contiene entre 1,5 y 33,5 repeticiones que suelen tener 34 residuos de longitud (la repetición C-terminal es generalmente más corta y se denomina "media repetición"). [7] Una secuencia de repetición típica es LTPEQVVAIAS HD GGKQALETVQRLLPVLCQAHG , pero los residuos en las posiciones 12 y 13 son hipervariables (estos dos aminoácidos también se conocen como diresiduo variable de repetición o RVD). Existe una relación simple entre la identidad de estos dos residuos en repeticiones secuenciales y bases de ADN secuenciales en el sitio diana del efector TAL. [8] La estructura cristalina de un efector TAL unido al ADN indica que cada repetición comprende dos hélices alfa y un bucle corto que contiene RVD donde el segundo residuo del RVD hace contactos de ADN específicos de la secuencia mientras que el primer residuo del RVD estabiliza el bucle que contiene RVD. [10] [11] Los sitios diana de los efectores TAL también tienden a incluir una timina que flanquea la base 5' a la que se dirige la primera repetición; esto parece deberse a un contacto entre esta T y un triptófano conservado en la región N-terminal del dominio de repetición central. [10] Sin embargo, esta posición "cero" no siempre contiene una timina, ya que algunos andamiajes son más permisivos. [12]

El código TAL-ADN fue descifrado por dos grupos separados en 2010. [8] El primer grupo, encabezado por Adam Bogdanove , descifró este código computacionalmente al buscar patrones en alineaciones de secuencias de proteínas y secuencias de ADN de promotores objetivo derivados de una base de datos de genes regulados positivamente por TALE. [13] El segundo grupo (Boch) dedujo el código a través del análisis molecular del efector TAL AvrBs3 y su secuencia de ADN objetivo en el promotor de un gen de pimiento activado por AvrBs3. [14] El código validado experimentalmente entre la secuencia RVD y la base de ADN objetivo se puede expresar de la siguiente manera:

Genes objetivo

Los efectores TAL pueden inducir genes de susceptibilidad que son miembros de la familia de genes NODULIN3 (N3). Estos genes son esenciales para el desarrollo de la enfermedad. En el arroz, dos genes, Os-8N3 y Os-11N3, son inducidos por efectores TAL. Os-8N3 es inducido por PthXo1 y Os-11N3 es inducido por PthXo3 y AvrXa7. Existen dos hipótesis sobre las posibles funciones de las proteínas N3:

Efectores TAL de ingeniería

Esta simple correspondencia entre los aminoácidos de los efectores TAL y las bases de ADN en sus sitios diana los hace útiles para aplicaciones de ingeniería de proteínas. Numerosos grupos han diseñado efectores TAL artificiales capaces de reconocer nuevas secuencias de ADN en una variedad de sistemas experimentales. [14] [16] [17] [18] [19] [20] Dichos efectores TAL diseñados se han utilizado para crear factores de transcripción artificiales que se pueden utilizar para dirigir y activar o reprimir genes endógenos en tomate , [16] Arabidopsis thaliana , [16] y células humanas. [17] [19] [9] [21]

Las construcciones genéticas para codificar proteínas basadas en efectores TAL se pueden realizar utilizando síntesis genética convencional o ensamblaje modular. [19] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] Un kit de plásmidos para ensamblar TALEN personalizados y otras construcciones de efectores TAL está disponible a través del repositorio público sin fines de lucro Addgene . Las páginas web que brindan acceso a software público, protocolos y otros recursos para aplicaciones de orientación de ADN de efectores TAL incluyen TAL Effector-Nucleotide Targeter y taleffectors.com.

Aplicaciones

Los efectores TAL diseñados también se pueden fusionar al dominio de escisión de FokI para crear nucleasas efectoras TAL (TALEN) o a meganucleasas (nucleasas con sitios de reconocimiento más largos) para crear "megaTAL". [28] Estas fusiones comparten algunas propiedades con las nucleasas de dedos de zinc y pueden ser útiles para aplicaciones de ingeniería genética y terapia génica . [29]

Los enfoques basados ​​en TALEN se utilizan en los campos emergentes de edición genética e ingeniería genómica . Las fusiones de TALEN muestran actividad en un ensayo basado en levadura, [18] [30] en genes endógenos de levadura, [22] en un ensayo de reportero de planta, [20] en un gen endógeno de planta, [23] en genes endógenos de pez cebra , [31] [32] en un gen endógeno de rata , [33] y en genes humanos endógenos. [17] [23] [34] El gen humano HPRT1 ha sido dirigido a niveles detectables, pero no cuantificados. [23] Además, las construcciones TALEN que contienen el dominio de escisión FokI fusionado a una porción más pequeña del efector TAL que aún contiene el dominio de unión al ADN se han utilizado para dirigirse a los genes endógenos NTF3 y CCR5 en células humanas con eficiencias de hasta el 25%. [17] Las nucleasas efectoras TAL también se han utilizado para diseñar células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas (IPSC) [34] y para eliminar el gen ben-1 endógeno en C. elegans . [35]

La modificación de unión de extremos no homólogos inducida por TALE se ha utilizado para producir una nueva resistencia a enfermedades en el arroz. [1]

Véase también

Referencias

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Lectura adicional

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