Los activadores de transcripción similares a los efectores similares ( TALE-likes ) son un grupo de proteínas bacterianas de unión al ADN que reciben su nombre del primer grupo y aún mejor estudiado, las TALE de la bacteria Xanthomonas . Las TALE son factores importantes en las enfermedades de las plantas causadas por la bacteria Xanthomonas , pero se conocen principalmente por su papel en la biotecnología como proteínas programables de unión al ADN, particularmente en el contexto de las nucleasas TALE . Además, se han encontrado TALE-likes en muchas cepas del complejo de especies bacterianas Ralstonia solanacearum, en la cepa HKI 454 de Paraburkholderia rhizoxinica y en dos bacterias marinas desconocidas. Todavía no está claro si todas estas proteínas forman o no una única agrupación filogenética.
La característica unificadora de los TALE-likes son sus conjuntos en tándem de repeticiones de unión al ADN. Estas repeticiones tienen, con pocas excepciones, una longitud de 33 a 35 aminoácidos y están compuestas por dos hélices alfa a cada lado de un bucle flexible que contiene los residuos de unión a las bases del ADN y con repeticiones vecinas unidas por bucles de enlace flexibles. [1] La evidencia de esta estructura común proviene en parte de las estructuras cristalinas resueltas de los TALE [2] y un TALE-like de Burkholderia (BAT), [3] pero también de la conservación del código que todos los TALE-likes usan para reconocer secuencias de ADN. De hecho, las repeticiones TALE, RipTAL y BAT se pueden mezclar y combinar para generar proteínas de unión al ADN funcionales con afinidad variable. [4]
Los TALE son el primer grupo identificado, mejor estudiado y más grande dentro de los similares a TALE. Los TALE se encuentran en todo el género bacteriano Xanthomonas [5] , que comprende principalmente patógenos de plantas. Se ha demostrado que todos los TALE que se han estudiado se secretan como parte del sistema de secreción de tipo III en las células vegetales hospedadoras. Una vez dentro de la célula hospedadora, se translocan al núcleo, se unen a secuencias de ADN específicas dentro de los promotores hospedadores y activan genes posteriores. Se cree que cada parte de este proceso se conserva en todos los TALE. La única diferencia significativa entre los TALE individuales, según el conocimiento actual, es la secuencia de ADN específica a la que se une cada TALE. Los TALE de cepas incluso estrechamente relacionadas difieren en la composición de las repeticiones que forman su dominio de unión al ADN. [6] La composición de las repeticiones determina la preferencia de unión al ADN. En particular, la posición 13 de cada repetición confiere la preferencia de base de ADN de cada repetición. Durante las primeras investigaciones se observó que casi todas las diferencias entre repeticiones de una única matriz de repeticiones TALE se encuentran en las posiciones 12 y 13 y este hallazgo condujo a la hipótesis de que estos residuos determinan la preferencia de base. [7] De hecho, se dice comúnmente que las posiciones de repetición 12 y 13, denominadas conjuntamente como el Diresiduo Variable de Repetición (RVD), confieren especificidad de base a pesar de la clara evidencia de que la posición 13 es el residuo determinante de la base. [8] Además del dominio de repetición, los TALE también poseen una serie de características conservadas en los dominios que flanquean las repeticiones. Estos incluyen dominios para la secreción de tipo III, la localización nuclear y la activación transcripcional. Esto permite que los TALE lleven a cabo su función biológica como proteínas efectoras secretadas en las células de la planta huésped para activar la expresión de genes huéspedes específicos.
Aunque las posiciones RVD son comúnmente las únicas posiciones variables dentro de una única matriz de repeticiones TALE, existen más diferencias cuando se comparan matrices de repeticiones de diferentes TALE. La diversidad de TALE en todo el género Xanthomonas es considerable, pero un hallazgo particularmente sorprendente es que la historia evolutiva a la que se llega al comparar composiciones de repeticiones difiere de la que se encuentra al comparar secuencias no repetidas. [6] Se cree que las matrices de repeticiones de TALE evolucionan rápidamente, y se sugiere que una serie de procesos recombinatorios dan forma a la evolución de la matriz de repeticiones. [5] La recombinación de matrices de repeticiones TALE se ha demostrado en un experimento de selección forzada. [9] Se cree que este dinamismo evolutivo es posible gracias a la identidad de secuencia muy alta de las repeticiones TALE, que es una característica única de los TALE en comparación con otros similares.
Otra característica única de los TALE es un conjunto de cuatro estructuras repetidas en el flanco N-terminal de la matriz de repeticiones central. Se ha demostrado que estas estructuras, denominadas repeticiones no canónicas o degeneradas, son vitales para la unión del ADN, [10] aunque todas menos una no entran en contacto con bases de ADN y, por lo tanto, no contribuyen a la preferencia de secuencia. La única excepción es la repetición -1, que codifica una preferencia fija de T-cero para todos los TALE. Esto significa que las secuencias objetivo de los TALE siempre están precedidas por una base de timina. Se cree que esto es común a todos los TALE, con la posible excepción de TalC de la cepa AXO1947 ( G1FM79 ) de Xanthomonas oryzae pv. oryzae . [11]
En la publicación de 2002 del genoma de la cepa de referencia Ralstonia solanacearum GMI1000 se observó que su genoma codifica una proteína similar a las TALE de Xanthomonas . [12] Con base en la estructura de dominios y secuencias repetidas similares, se presumió que este gen y los homólogos en otras cepas de Ralstonia codificarían proteínas con las mismas propiedades moleculares que las TALE, incluida la unión al ADN específica de la secuencia. En 2013, esto fue confirmado por dos estudios. [13] [14] Estos genes y las proteínas que codifican se denominan RipTAL (proteína inyectada de Ralstonia similar a TALE) de acuerdo con la nomenclatura estándar de los efectores de Ralstonia. [15] Si bien el código de unión al ADN de las repeticiones centrales se conserva con las TALE, las RipTAL no comparten la preferencia T-cero, en cambio tienen un requisito estricto G-cero. [13] Además, las repeticiones dentro de una única matriz de repeticiones RipTAL tienen múltiples diferencias de secuencia más allá de las posiciones RVD, a diferencia de las repeticiones casi idénticas de TALE.
Se han encontrado RipTAL en los cuatro filotipos de R. solanacearum , lo que lo convierte en una característica ancestral de este clado. A pesar de las diferencias en los dominios flanqueantes, las secuencias a las que se dirigen sus RVD son muy similares. [16]
Varias líneas de evidencia apoyan la idea de que las RipTAL funcionan como proteínas efectoras, promoviendo el crecimiento bacteriano o la enfermedad al manipular la expresión de genes vegetales. Son secretadas en las células vegetales por el sistema de secreción Tipo III , que es el principal sistema de administración de proteínas efectoras. [17] Se localizan en el núcleo celular y pueden funcionar como factores de transcripción específicos de secuencia en las células vegetales. [13] Además, se demostró que una cepa que carecía de su RipTAL crecía más lentamente dentro del tejido de la hoja de berenjena que el tipo salvaje. [18] Además, un estudio basado en polimorfismos de ADN en secuencias de dominio de repetición de ripTAL y plantas hospedantes encontró una conexión estadísticamente significativa entre la planta hospedante y las variantes del dominio de repetición. [19] Esto es de esperar si las RipTAL de diferentes cepas se adaptan a genes diana en plantas hospedantes específicas. A pesar de esto, no se han identificado genes diana para ninguna RipTAL, a junio de 2019 [actualizar].
La publicación del genoma de la cepa bacteriana Paraburkholderia rhizoxinica HKI 454, en 2011 [20] condujo al descubrimiento de un conjunto de genes similares a TALE que diferían considerablemente en naturaleza de los TALE y RipTALS. Las proteínas codificadas por estos genes fueron estudiadas por sus propiedades de unión al ADN por dos grupos de forma independiente y llamados Bats (Burkholderia TALE-likes; E5AV36 ) o BurrH. [21] [22] Esta investigación mostró que las unidades repetidas de los Burkholderia TALE-likes se unen al ADN con el mismo código que los TALE, gobernado por la posición 13 de cada repetición. Sin embargo, existen varias diferencias.
Las Burkholderia TALE-likes están compuestas casi en su totalidad de repeticiones, careciendo de los grandes dominios no repetitivos que se encuentran flanqueando las repeticiones en TALEs y RpTALs. Esos dominios son clave para las funciones de TALEs y RipTALs permitiéndoles infiltrarse en el núcleo de la planta y activar la expresión génica. Por lo tanto, actualmente no está claro cuáles son las funciones biológicas de Burkholderia TALE-likes. Lo que está claro es que no son proteínas efectoras secretadas en las células vegetales para actuar como factores de transcripción, la función biológica de TALEs y RipTALs. No es inesperado que puedan diferir en funciones biológicas de TALEs y RipTALs ya que el estilo de vida de la bacteria de la que derivan es muy diferente al de las bacterias portadoras de TALE y RipTAL. B. rhizoxinica es un endosimbionte, que vive dentro de un hongo, a diferencia de Rhizopus microsporus , un patógeno vegetal. El mismo hongo también es un patógeno humano oportunista en pacientes inmunodeprimidos, pero mientras que B. rhizoxinica es necesario para la patogenicidad en las plantas hospedantes, es irrelevante para la infección humana. [23] No está claro si los hongos similares a Burkholderia TALE se secretan alguna vez en el hongo, y mucho menos en las plantas hospedantes.
Como se señala en las publicaciones sobre Burkholderia TALE-likes puede haber algunas ventajas en usar estas proteínas como un andamiaje para que las proteínas programables de unión al ADN funcionen como factores de transcripción o nucleasas de diseño, en comparación con las TALE. [21] [22] Se ha fusionado con una nucleasa FokI análoga a TALEN . [3] Las ventajas incluyen un tamaño de repetición más corto, una estructura de dominio más compacta (sin dominios grandes que no se repitan), una mayor diversidad de secuencias repetidas que permite el uso de PCR en los genes que las codifican y las hace menos vulnerables a la pérdida de repeticiones recombinatorias. Además, Burkholderia TALE-likes no tiene ningún requisito de T-cero que relaje las restricciones en la selección del objetivo de ADN. Sin embargo, se han publicado pocos usos de Burkholderia TALE-likes como proteínas programables de unión al ADN, fuera de las publicaciones de caracterización original.
En 2007, los resultados de un barrido metagenómico de los océanos del mundo por el Instituto J. Craig Venter se hicieron públicos. [24] El artículo de 2014 sobre TALE-likes de Burkholderia [22] también fue el primero en informar que dos entradas de esa base de datos se parecían a TALE-likes, basándose en la similitud de secuencia. Estas se caracterizaron y evaluaron aún más por su potencial de unión al ADN en 2015. [25] Se encontró que las unidades repetidas codificadas por estas secuencias mediaban la unión al ADN con una preferencia de base que coincidía con el código TALE, y se juzgó que probablemente formaban estructuras casi idénticas a las repeticiones de Bat1 según simulaciones de dinámica molecular . Por lo tanto, las proteínas codificadas por estas secuencias de ADN se designaron como TALE-likes de organismos marinos (MOrTLs) 1 y 2 ( GenBank : ECG96325 , EBN91409 ). [25] Las secuencias similares encontradas en metagenomas incluyen EBN19408 y ECR81667 . [26]
Aunque las repeticiones de MOrTL1 y 2 se ajustan estructural y funcionalmente a la norma de tipo TALE, difieren considerablemente a nivel de secuencia tanto de todos los demás tipos TALE como entre sí. No se sabe si son verdaderamente homólogas de los otros tipos TALE y, por lo tanto, constituyen junto con los TALE, RipTAL y Bats una verdadera familia de proteínas . Alternativamente, pueden haber evolucionado de forma independiente. Es particularmente difícil juzgar la relación con los otros tipos TALE porque casi nada se sabe de los organismos de los que provienen MOrTL1 y MOrTL2. Solo se sabe que se encontraron en dos muestras de agua de mar separadas del Golfo de México y es probable que sean bacterias según la exclusión por tamaño antes de la secuenciación del ADN. [25]
En julio de 2012 se presentó una patente para BAT y TALE-likes marinos en ingeniería de proteínas. A mayo de 2019 [actualizar], está pendiente en todas las jurisdicciones. [27]