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Efector similar a un activador de la transcripción

Los efectores TAL ( tipo activador de la transcripción ) (a menudo denominados TALE , pero que no deben confundirse con la clase de proteínas homeobox de extensión de bucle de tres aminoácidos ) son proteínas secretadas por algunas proteobacterias β y γ . [1] La mayoría de ellas son xantomonas . Las bacterias fitopatógenas Xanthomonas son especialmente conocidas por los TALE, producidos a través de su sistema de secreción tipo III . Estas proteínas pueden unirse a secuencias promotoras en la planta huésped y activar la expresión de genes vegetales que ayudan a la infección bacteriana. Se sabe que el dominio TALE responsable de la unión al ADN tiene de 1,5 a 33,5 secuencias cortas que se repiten varias veces (repeticiones en tándem). [2] Se descubrió que cada una de estas repeticiones era específica para un determinado par de bases del ADN. [2] Estas repeticiones también tienen residuos variables repetidos (RVD) que pueden detectar pares de bases de ADN específicos. [2] Reconocen secuencias de ADN de plantas a través de un dominio de repetición central que consta de un número variable de ~34 repeticiones de aminoácidos. Parece haber una correspondencia uno a uno entre la identidad de dos aminoácidos críticos en cada repetición y cada base de ADN en la secuencia objetivo. Estas proteínas son interesantes para los investigadores tanto por su papel en las enfermedades de importantes especies de cultivos como por la relativa facilidad de reorientarlas para que se unan a nuevas secuencias de ADN. Se pueden encontrar proteínas similares en la bacteria patógena Ralstonia solanacearum [3] [4] [1] y Burkholderia rhizoxinica , [5] [1], así como en microorganismos marinos aún no identificados. [6] El término TALE-likes se utiliza para referirse a la supuesta familia de proteínas que abarca las TALE y estas proteínas relacionadas.

Función en la patogénesis de las plantas.

xantomonas

Las xantomonas son bacterias gramnegativas que pueden infectar una amplia variedad de especies de plantas, incluidas pimienta, arroz, cítricos, algodón, tomate y soja. [7] Algunos tipos de Xanthomonas causan mancha foliar localizada o raya foliar, mientras que otros se propagan sistémicamente y causan pudrición negra o tizón foliar. Inyectan una serie de proteínas efectoras, incluidos los efectores TAL, en la planta a través de su sistema de secreción tipo III . Los efectores TAL tienen varios motivos normalmente asociados con eucariotas, incluidas múltiples señales de localización nuclear y un dominio de activación ácido. Cuando se inyectan en plantas, estas proteínas pueden ingresar al núcleo de la célula vegetal, unirse a secuencias promotoras de plantas y activar la transcripción de genes vegetales que ayudan en la infección bacteriana. [7] Las plantas han desarrollado un mecanismo de defensa contra los efectores de tipo III que incluye genes R (resistencia) desencadenados por estos efectores. Algunos de estos genes R parecen haber evolucionado para contener sitios de unión efectores TAL similares al sitio en el gen diana deseado. Se ha planteado la hipótesis de que esta competencia entre las bacterias patógenas y la planta huésped explica la naturaleza aparentemente maleable del dominio de unión al ADN efector TAL. [8]

No Xanthomonas

R. solanacearum , B. rhizoxinica y enfermedad de la sangre del banano (una bacteria aún no identificada definitivamente, en el grupo de especies de R. solanacearum ). [1]

reconocimiento de ADN

La característica más distintiva de los efectores TAL es un dominio de repetición central que contiene entre 1,5 y 33,5 repeticiones que generalmente tienen 34 residuos de longitud (la repetición C-terminal es generalmente más corta y se denomina "media repetición"). [7] Una secuencia repetida típica es LTPEQVVAIAS HD GGKQALETVQRLLPVLCQAHG , pero los residuos en las posiciones 12 y 13 son hipervariables (estos dos aminoácidos también se conocen como residuo variable repetido o RVD). Existe una relación simple entre la identidad de estos dos residuos en repeticiones secuenciales y bases de ADN secuenciales en el sitio objetivo del efector TAL. [8] La estructura cristalina de un efector TAL unido al ADN indica que cada repetición comprende dos hélices alfa y un bucle corto que contiene RVD donde el segundo residuo del RVD establece contactos de ADN específicos de secuencia mientras que el primer residuo del RVD estabiliza el Bucle que contiene RVD. [10] [11] Los sitios objetivo de los efectores TAL también tienden a incluir una timina que flanquea la base 5' objetivo de la primera repetición; esto parece deberse a un contacto entre esta T y un triptófano conservado en la región N-terminal del dominio repetido central. [10] Sin embargo, esta posición "cero" no siempre contiene timina, ya que algunos andamios son más permisivos. [12]

El código TAL-DNA fue descifrado por dos grupos separados en 2010. [8] El primer grupo, encabezado por Adam Bogdanove , descifró este código computacionalmente buscando patrones en alineamientos de secuencias de proteínas y secuencias de ADN de promotores diana derivados de una base de datos de genes. regulado positivamente por TALE. [13] El segundo grupo (Boch) dedujo el código mediante análisis molecular del efector TAL AvrBs3 y su secuencia de ADN diana en el promotor de un gen de la pimienta activado por AvrBs3. [14] El código validado experimentalmente entre la secuencia RVD y la base del ADN objetivo se puede expresar de la siguiente manera:

Genes diana

Los efectores TAL pueden inducir genes de susceptibilidad que son miembros de la familia de genes NODULIN3 (N3). Estos genes son esenciales para el desarrollo de la enfermedad. En el arroz, dos genes, Os-8N3 y Os-11N3, son inducidos por efectores TAL. Os-8N3 es inducido por PthXo1 y Os-11N3 es inducido por PthXo3 y AvrXa7. Existen dos hipótesis sobre posibles funciones de las proteínas N3:

Efectores TAL de ingeniería

Esta simple correspondencia entre los aminoácidos en los efectores TAL y las bases del ADN en sus sitios objetivo los hace útiles para aplicaciones de ingeniería de proteínas. Numerosos grupos han diseñado efectores TAL artificiales capaces de reconocer nuevas secuencias de ADN en diversos sistemas experimentales. [14] [16] [17] [18] [19] [20] Estos efectores TAL diseñados se han utilizado para crear factores de transcripción artificiales que pueden usarse para apuntar y activar o reprimir genes endógenos en el tomate , [16] Arabidopsis thaliana , [16] y células humanas. [17] [19] [9] [21]

Las construcciones genéticas para codificar proteínas basadas en efectores TAL se pueden elaborar mediante síntesis genética convencional o ensamblaje modular. [19] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] Un kit de plásmido para ensamblar TALEN personalizado y otras construcciones efectoras TAL está disponible a través del repositorio público sin fines de lucro Addgene . Las páginas web que brindan acceso a software público, protocolos y otros recursos para aplicaciones de focalización de ADN efector TAL incluyen TAL Effector-Nucleotide Targeter y taleffectors.com.

Aplicaciones

Los efectores TAL diseñados también se pueden fusionar con el dominio de escisión de FokI para crear nucleasas efectoras TAL (TALEN) o con meganucleasas (nucleasas con sitios de reconocimiento más largos) para crear "megaTAL". [28] Estas fusiones comparten algunas propiedades con las nucleasas de dedos de zinc y pueden ser útiles para aplicaciones de ingeniería genética y terapia génica . [29]

Los enfoques basados ​​en TALEN se utilizan en los campos emergentes de la edición de genes y la ingeniería genómica . Las fusiones TALEN muestran actividad en un ensayo basado en levadura, [18] [30] en genes endógenos de levadura, [22] en un ensayo informador de plantas, [20] en un gen endógeno de plantas, [23] en genes endógenos de pez cebra , [31 ] [32] en un gen endógeno de rata , [33] y en genes humanos endógenos. [17] [23] [34] El gen HPRT1 humano se ha dirigido a niveles detectables, pero no cuantificados. [23] Además, se han utilizado construcciones TALEN que contienen el dominio de escisión FokI fusionado a una porción más pequeña del efector TAL que aún contiene el dominio de unión al ADN para atacar los genes endógenos NTF3 y CCR5 en células humanas con eficiencias de hasta el 25 %. [17] Las nucleasas efectoras TAL también se han utilizado para diseñar células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas (IPSC) [34] y para desactivar el gen endógeno ben-1 en C. elegans . [35]

La modificación de la unión de extremos no homóloga inducida por TALE se ha utilizado para producir nueva resistencia a enfermedades en el arroz. [1]

Ver también

Referencias

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Otras lecturas

enlaces externos