La L -fotometionina es un derivado aminoácido fotorreactivo de la L -metionina que se formó sintéticamente en 2005. [1] Las proteínas son largas cadenas poliméricas de aminoácidos ; que pueden variar en varias estructuras y tamaños. Las proteínas pueden interactuar entre sí ( interacciones proteína-proteína o PPI) y con estas interacciones, afectan las interacciones y vías celulares. [1] Tales interacciones; en la fusión viral y en la señalización del factor de crecimiento parecían prometedoras para los medicamentos antivirales o anticancerígenos, por lo que se debe realizar investigación para comprender las interacciones. [1] Con eso, la investigación ha comenzado a demostrar que las proteínas funcionan en complejos supramoleculares en comparación con entidades aisladas. [1] Entonces, los científicos Monika Suchanek, Anna Radzikowski y Christoph Thiele investigaron que la forma directa de estudiar mejor estas interacciones en el entorno natural era crear una nueva forma de fotoentrecruzamiento de proteínas; lo que condujo a la síntesis de L -fotometionina y en ese mismo estudio, L -fotoleucina . [1]
La fotometionina racémica se sintetiza a partir de 4,4'-azi-pentanal mediante la síntesis de aminoácidos de Strecker . [1] El enantiómero L se separa mediante resolución enzimática de la acetamida.
Como se mencionó anteriormente, la L-foto-metionina se puede utilizar para estudiar las interacciones proteína-proteína con las proteínas en su entorno nativo. Esto es posible porque el aminoácido se comporta cuando se expone a la luz ultravioleta. [1] Para demostrar que la síntesis funciona, primero se agrega carbono radiactivo ( 14 C) a su propia síntesis para realizar métodos espectroscópicos adecuados.
Debido a que la síntesis anterior había funcionado, la fotometionina es fotorreactiva debido al anillo de diazirina . Una vez que este anillo se ha expuesto a la luz ultravioleta, el nitrógeno sale como gas nitrógeno (N 2 ) y forma el intermediario altamente reactivo carbeno . [1] La fotoactivación de aminoácidos proporciona la capacidad de fotoentrecruzamiento en proteínas. [1] Este tipo de entrecruzamiento tiene tres ventajas principales: hay una mayor especificidad para este entrecruzamiento debido a los intermediarios de vida corta y que este aminoácido es funcional y, lo más importante; no tóxico (lo que significa que no debería alterar drásticamente la función o la estructura de la proteína). [1] La investigación ha descubierto que esta activación es el paso limitante de la velocidad; no el entrecruzamiento. [2]
Los científicos Miquel Vila-Perello, Matthew R. Pratt, Frej Tulin y Tom W. Muir querían crear una síntesis eficiente, ya que la original requería una solución enzimática y tenía un bajo rendimiento. [3] Así que empezaron con ácido L-glutámico con grupos protectores tanto en el ácido carboxílico (tert-butilo) como en la amina Boc. Esta síntesis no se explicará en detalle como la clásica, pero a continuación se muestra la síntesis completa. Para encontrar los pasos exactos, consulte la referencia. [3]
Entonces, una vez que sintetizaron L-foto-metionina, el rendimiento fue del 32%, mucho más alto (por seis veces) que la síntesis original. [3] Se utilizó entonces (con un grupo de protección Fmoc en la amina) que ese producto sufriera más pasos sintéticos para estudiar si un reticulador de aminoácidos y una modificación postraduccional (PTM) podrían introducirse en el mismo sitio de la proteína específicamente para capturar una interacción covalente del aminoácido que depende de la PTM. [3] Las PTM regulan las interacciones proteína-proteína que tienen características que son transitorias y subestequiométricas; lo que las hace difíciles de detectar por métodos estándar. [3] Entonces, para ver si funcionaría, se utilizó el dominio MH2 de Smad2 porque se sabe que esta proteína de señalización forma homo-trímeros estables una vez que entran en contacto con residuos de serina fosforilados por el receptor . [3] La ligación de proteínas de expresión (conocida como EPL) se utilizó para sintetizar y formar Smad2-MH2-CSpSM-photo-Met (1). El producto se estudió con el agente de entrecruzamiento (photo-Met) contra una proteína de control: HA-MH2-CSpSMpS (que carece de foto-metionina, 2) utilizando SDS-PAGE y transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-HA. [3] 1 había generado dos especies principales de entrecruzamiento que tienen un peso molecular consistente con un dímero y trímero de Smad2-SH2. Sin ese agente de entrecruzamiento, el dímero y el trímero apenas se detectaron en el 1 no irradiado, y en el 2 antes y después de la irradiación UV. [3] Demostrando que la l-foto-metionina se puede utilizar con EPL y podría usarse para determinar una interacción transitoria MH2-MH2 que dependía de un PTM. [3]
Como se mencionó anteriormente, los científicos Monika Suchanek, Anna Radzikowski y Christoph Thiele querían estudiar la interacción proteína-proteína en su entorno natural. Específicamente, las proteínas de membrana (en un complejo y son SCAP , Insig-1 y SREBP ) que regulan la homeostasis del colesterol, por lo que querían saber cuál era su función y la estructura del complejo. [1] Lo que habían descubierto fue que el uso de este aminoácido fotorreactivo se incorporaba de manera eficiente a la proteína por las células de mamíferos, pero no necesitaba usar ARNt modificados (ARN de transferencia) o AARS (síntesis de ARNt de aminoacilo) que permitían la reticulación específica necesaria. [1] Esta reticulación se podía determinar mediante transferencia Western y habían descubierto una interacción directa entre Insig-1 y PGRMC1 (una proteína de membrana que se une a la progesterona ). [1] Las cuatro proteínas de membrana se encuentran en el retículo endoplasmático y el complejo responde a niveles bajos de colesterol. [1] Las células ( COS7 ) que tenían HA ( PGRMC1 marcado con hemaglutinina ) e Insig-1 marcado con Myc se cultivaron con y sin foto-Met. En presencia de foto-Met, Insig-1 y SCAP se habían reticulado con PGRMC1; específicamente, Insig-1 reticulado tenía una banda fuerte. [1] La reticulación se detectó inmunoprecipitando extractos de detergente con un anticuerpo para HA, luego se probó el precipitante para Insig-1 usando transferencia Western con el anticuerpo para Myc. [1] Se encontró una banda idéntica haciendo el orden inverso de la detección; lo que significa que el anticuerpo Myc se inmunoprecipitó y luego se transfirió con el anticuerpo HA. [1] Entonces, el método había demostrado que funcionaba que el foto-Met podía reticular proteínas, pero las implicaciones fisiológicas de esta reticulación aún deben determinarse.
La proteína se estudió utilizando una nanosonda de proteínas (que permite la reticulación) que introdujo fotometionina dentro de la proteína (durante la expresión recombinante) lo que llevó a que la proteína mantuviera su estructura reservada mientras tenía la capacidad de ser mapeada para sus interacciones. El modelo se utilizó como una región de superficie de contacto que está involucrada en una interacción bien conocida (homodimerización) entre dos moléculas de proteína 14-3-3ζ . Una vez que se introduce la fotometionina y se ha activado utilizando luz UV, puede reticularse sin especificidad (es decir, sin grupo) y los enlaces tienen longitud cero. La espectrometría de masas de alta resolución o MS (incluso MS/MS) se puede utilizar entonces para determinar los residuos reticulados y el radio de reacción; lo que permite a los investigadores caracterizar e investigar la homodimerización de la proteína. El uso de MS de alta resolución con fotometionina tiene sus ventajas, ya que nuevamente permite que la proteína esté en su estado nativo, hay escalas de tiempo razonables mientras se utilizan pequeñas cantidades de la proteína. También existen menos limitaciones en la especificidad de la reacción y restricciones al usar un reticulante fotoactivo (fotometionina) en comparación con el reticulado químico . Este método de reticulación fotoiniciada combinada a partir de la nanosonda de proteína en tándem con MS podría ser útil para caracterizar no solo la formación de homodímeros sino también oligómeros y, en teoría; heterómeros (como la composición de la mezcla proteína-proteína y su funcionalidad). [4]
El citocromo b 5 se sintetizó con fotometionina para mapear las interacciones proteína-proteína mientras también se identificaba su estructura para estudiar el sistema de oxidasa de función mixta de mamíferos (también conocido como MFO). [5] Este sistema está ubicado en la membrana del retículo endoplasmático y está compuesto por citocromo P450 , NADPH : citocromo P450 reductasa y citocromo b 5 junto con NADH : citocromo b 5 reductasa . [ cita requerida ] Una vez que el complejo de citocromo b 5 tuvo fotometionina incorporada (lo que significa que se sustituyó foto-met en lugar de metionina y ahora foto-cito b 5 ), el foto-cito b 5 y el citocromo P450 se colocaron bajo luz ultravioleta y los productos pudieron estudiarse usando SDS-Page ; este método había mostrado tres enlaces cruzados. [ cita requerida ] La foto-metionina ha demostrado ser exitosa en el mapeo de foto-cito b 5 ya que el método MALDI-TOF mostró tres oligómeros (de péptidos quimotripsinos) que estaban compuestos de foto-cito b 5 y citocromo P450 en proporciones de peso molecular de 1:1, 1:2 y 2:1. [ cita requerida ] Lo que hace que la foto-metionina aquí sea tan útil para estudiar el citocromo P450 y el citocromo b 5 es que este método no solo mapeó las interfaces proteína-proteína no solo en regiones expuestas al solvente, sino también en el entorno nativo; la membrana. [5] Un método de reticulación típico solo puede funcionar en regiones expuestas al solvente, lo que demuestra una vez más que la foto-metionina es útil para mapear estas interacciones proteína-proteína con la proteína en su entorno nativo. [5]
Las lamininas son proteínas no colágenas que se encuentran en las membranas basales y forman redes a través de autointeracciones no covalentes. Los nidogenos (también conocidos como entactinas) son glicoproteínas monoméricas sulfatadas que están presentes de forma ubicua en las membranas basales de los organismos superiores. Los nidogenos ayudan a la formación de la base. Con la presencia de lamininas y nidogenos, ambos interactúan entre sí para tener una relación estequiométrica de 1:1 en un complejo. Para estudiar el brazo corto de la laminina γ1, se introdujo fotometionina tanto en el nidogen-1 , la laminina γ1 LEb2-4 y el brazo corto de la laminina γ1 para ver si este método de fotoentrecruzamiento podía mapear la estructura. El análisis MS/MS se realizó antes de la reticulación y se encontró que solo se había incorporado entre el 13 y el 25 % de metioninas, pero una vez que se realizó la reticulación inducida por UV-A u otro reticulante, BS 2 G (un reticulante homobifuncional), el porcentaje de fotometioninas había aumentado al 35 %. Ambos reticulantes habían demostrado una comprensión estructural adicional tanto a nivel computacional como experimental para ayudar a comprender las funciones. [6]
Se estudiaron las estructuras de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y la prostaglandina E 2 sintasa microsomal-1 (mPGES-1) utilizando fotometionina (fotoactivable) y reticuladores bifuncionales. La fotometionina utilizada en la COX-2 había demostrado, al igual que el reticulador bifuncional, que existía una estructura dimérica que era consistente con la estructura cristalina de la enzima. En mPGES-1, las células humanas ( A549 ) que habían sido tratadas con suberato de disuccinimidilo (reticulador químico) habían producido un dímero de 33 kDa y un trímero de 45 kDa, mientras que el tratamiento con fotometionina había producido un dímero del mismo peso molecular (33 kDa) y dos trímeros putativos (50 kDa y 55 kDa). Una vez que se introdujo un inhibidor de mPGES-1 (MF63), esto había inhibido la formación de los complejos de 50 kDa y 55 kDa. El dímero y trímero producidos por el agente de reticulación química no se vieron afectados por el inhibidor. Sin embargo, ni la fotometionina ni el suberato de disuccinimidilo habían mostrado interacciones proteína-proteína entre COX-2 y mPGES-1 y esto podría deberse a varias razones. En el caso de la fotometionina, una de ellas podría deberse a la baja incorporación en ese momento, ya que era del 0,7 %. Por lo tanto, en el caso de mPGES-1, esta tiene 152 aminoácidos, por lo que solo se incorporaría una fotometionina por monómero. Eso también significa que no se reemplazaría una metionina específica, por lo que se obtendría una población heterogénea de mPGES-1 que daría lugar a diferentes reticulaciones. Aunque no mostró interacciones proteína-proteína, podría utilizarse para detectar cambios conformacionales de proteínas inducidos por inhibidores en las membranas celulares, además de determinar las estructuras oligoméricas. [7]
La fotometionina se puede utilizar para marcar proteínas recombinantes en células de Escherichia coli ; aunque la metionina en general es un aminoácido raro, lo que significa que solo podría proporcionar datos estructurales limitados. [8] Sin embargo, la fotometionina se incorporó a la proteína reguladora de Ca 2+ calmodulina (CaM que era de 17 kDa) que tiene nueve metioninas y se estudió mediante espectrometría de masas (MS). [9] Lo que hace que este método sea diferente es el uso de un medio de sales minerales en lugar de DMEM (medio limitante de Eagle modificado por Dulbecco) o suero bovino fetal dializado para la incorporación a las células. [9] El uso del medio de sal mineral permitió que las células se cultivaran desde el principio para eliminar pasos complicados con otros protocolos (incubar las células en medio LB , seguido de lavado e incubar más en el medio agotado), lo que significa que la fotometionina se pudo incorporar al comienzo del crecimiento celular que tuvo un alto rendimiento por encima del 30%. [9] La fotometionina no había mostrado daño durante el proceso de crecimiento celular y una vez fotoactivada por la luz UV-A, la CaM tenía nueve sitios de enlace cruzado distintos una vez que la EM había determinado que había picos de CaM marcada con fotometionina. [9] La fotometionina no solo se puede usar para mapear la estructura de proteínas en 3D, estudiando interacciones proteína-proteína, sino también regiones hidrofóbicas en la proteína. [9]