La electroporación , o electropermeabilización , es una técnica en la que se aplica un campo eléctrico a las células para aumentar la permeabilidad de la membrana celular . Esto puede permitir la introducción de sustancias químicas, fármacos, conjuntos de electrodos o ADN en la célula (también llamada electrotransferencia ). [1] [2] [3] [4]
En microbiología, el proceso de electroporación se utiliza a menudo para transformar bacterias , levaduras o protoplastos de plantas mediante la introducción de nuevo ADN codificante. Si se mezclan bacterias y plásmidos , los plásmidos se pueden transferir a las bacterias después de la electroporación, aunque, dependiendo de lo que se esté transfiriendo, también se podrían utilizar péptidos que penetren en las células o compresión celular . La electroporación funciona haciendo pasar miles de voltios (~8 kV/cm) a través de células suspendidas en una cubeta de electroporación. [2] Después, las células deben manipularse con cuidado hasta que hayan tenido la oportunidad de dividirse, produciendo nuevas células que contienen plásmidos reproducidos. Este proceso es aproximadamente diez veces más eficaz para aumentar la permeabilidad de la membrana celular que la transformación química , aunque muchos laboratorios carecen del equipo especializado necesario para la electroporación. [5] [6] [ verificación necesaria ]
La electroporación también es muy eficaz para la introducción de genes extraños en células de cultivo de tejidos, especialmente células de mamíferos . Por ejemplo, se utiliza en el proceso de producción de ratones knock-out , así como en el tratamiento de tumores, terapia génica y terapia basada en células. El proceso de introducción de ADN extraño en células eucariotas se conoce como transfección . La electroporación es muy eficaz para transfectar células en suspensión utilizando cubetas de electroporación. La electroporación ha demostrado ser eficaz para su uso en tejidos in vivo , para aplicaciones in utero , así como para la transfección in ovo . Las células adherentes también pueden transfectarse mediante electroporación, lo que proporciona a los investigadores una alternativa a la tripsinización de sus células antes de la transfección. Sin embargo, una desventaja de la electroporación es que después del proceso puede verse afectada la expresión génica de más de 7.000 genes. [7] Esto puede causar problemas en estudios en los que la expresión génica debe controlarse para garantizar resultados precisos y exactos.
Aunque la electroporación en masa tiene muchas ventajas sobre los métodos de administración física, como las microinyecciones y las pistolas de genes , aún tiene limitaciones, incluida la baja viabilidad celular. Se ha estudiado la miniaturización de la electroporación, lo que conduce a la microelectroporación y la nanotransfección de tejido utilizando técnicas basadas en la electroporación a través de nanocanales para administrar la carga a las células de manera mínimamente invasiva. [8] [9]
La electroporación también se ha utilizado como mecanismo para desencadenar la fusión celular . La fusión celular inducida artificialmente se puede utilizar para investigar y tratar diferentes enfermedades, como la diabetes, [10] [11] [12] regenerar axones del sistema nervioso central, [13] y producir células con propiedades deseadas, como en vacunas celulares para inmunoterapia contra el cáncer. [14] Sin embargo, la primera y más conocida aplicación de la fusión celular es la producción de anticuerpos monoclonales en la tecnología de hibridomas , donde se forman líneas celulares híbridas (hibridomas) fusionando linfocitos B productores de anticuerpos específicos con una línea celular de mieloma (cáncer de linfocitos B). [15]
La electroporación se realiza con electroporadores , aparatos diseñados específicamente para este fin que crean un campo electrostático en una solución celular. La suspensión celular se pipetea en una cubeta de vidrio o plástico que tiene dos electrodos de aluminio en sus lados. Para la electroporación bacteriana, normalmente se utiliza una suspensión de alrededor de 50 microlitros . Antes de la electroporación, esta suspensión de bacterias se mezcla con el plásmido que se va a transformar. La mezcla se pipetea en la cubeta, se ajustan el voltaje y la capacitancia y se inserta la cubeta en el electroporador. El proceso requiere contacto directo entre los electrodos y la suspensión. Inmediatamente después de la electroporación, se agrega un mililitro de medio líquido a las bacterias (en la cubeta o en un tubo Eppendorf ) y el tubo se incuba a la temperatura óptima de las bacterias durante una hora o más para permitir la recuperación de las células y la expresión del plásmido, seguido del cultivo bacteriano en placas de agar .
El éxito de la electroporación depende en gran medida de la pureza de la solución de plásmido, especialmente de su contenido de sal. Las soluciones con altas concentraciones de sal pueden causar una descarga eléctrica (conocida como arco eléctrico ), que a menudo reduce la viabilidad de las bacterias. Para una investigación más detallada del proceso, se debe prestar más atención a la impedancia de salida del dispositivo porador y a la impedancia de entrada de la suspensión de células (por ejemplo, el contenido de sal ).
Como la membrana celular no puede pasar corriente (excepto en los canales iónicos), actúa como un condensador eléctrico. Someter las membranas a un campo eléctrico de alto voltaje provoca su ruptura temporal, lo que genera poros lo suficientemente grandes como para permitir que las macromoléculas (como el ADN) entren o salgan de la célula. [16]
Además, la electroporación se puede utilizar para aumentar la permeabilidad de las células durante las inyecciones y cirugías intrauterinas. En particular, la electroporación permite una transfección más eficiente de ADN, ARN, ARNhc y todos los ácidos nucleicos en las células de ratones y ratas. El éxito de la electroporación in vivo depende en gran medida del voltaje, la repetición, los pulsos y la duración. Los sistemas nerviosos centrales en desarrollo son más eficaces para la electroporación in vivo debido a la visibilidad de los ventrículos para las inyecciones de ácidos nucleicos, así como a la mayor permeabilidad de las células en división. La electroporación de embriones inyectados in utero se realiza a través de la pared del útero, a menudo con electrodos tipo fórceps para limitar el daño al embrión. [17]
La electrotransferencia génica in vivo se describió por primera vez en 1991 [18] y hoy en día existen muchos estudios preclínicos sobre electrotransferencia génica. El método se utiliza para administrar una gran variedad de genes terapéuticos para el posible tratamiento de varias enfermedades, como: trastornos del sistema inmunológico, tumores, trastornos metabólicos, enfermedades monogénicas, enfermedades cardiovasculares, analgesia... [19] [20] [21]
En lo que respecta a la electroporación irreversible, el primer tratamiento exitoso de tumores cutáneos malignos implantados en ratones fue completado en 2007 por un grupo de científicos que lograron la ablación completa del tumor en 12 de 13 ratones. Lo lograron enviando 80 pulsos de 100 microsegundos a 0,3 Hz con una magnitud de campo eléctrico de 2500 V/cm para tratar los tumores cutáneos. [22] Actualmente, varias empresas, incluidas AngioDynamics, Inc. y VoltMed, Inc., continúan desarrollando e implementando tecnologías basadas en electroporación irreversible en entornos clínicos.
El primer grupo que estudió la electroporación para aplicaciones médicas fue dirigido por Lluis M Mir en el Instituto Gustave Roussy. En este caso, analizaron el uso de la electroporación reversible junto con macromoléculas impermeables. La primera investigación que analizó cómo se podrían utilizar los pulsos de nanosegundos en células humanas fue realizada por investigadores de la Escuela de Medicina de Virginia Oriental y la Universidad Old Dominion , y publicada en 2003. [23]
La primera aplicación médica de la electroporación fue la introducción de fármacos anticancerígenos de baja permeabilidad en nódulos tumorales. [24] Pronto también la electrotransferencia génica se volvió de especial interés debido a su bajo costo, facilidad de realización y seguridad. Es decir, los vectores virales pueden tener serias limitaciones en términos de inmunogenicidad y patogenicidad cuando se utilizan para la transferencia de ADN. [25]
La electroporación irreversible se está utilizando y evaluando como terapia de ablación cardíaca para matar áreas muy pequeñas del músculo cardíaco. Esto se hace para tratar irregularidades del ritmo cardíaco . Un catéter cardíaco administra trenes de pulsos eléctricos ultrarrápidos de alto voltaje que forman poros irreversibles en las membranas celulares, lo que resulta en la muerte celular. Se cree que permite una mejor selectividad que las técnicas anteriores, que usaban calor o frío para matar volúmenes más grandes de músculo. [26]
Se ha descubierto que un voltaje más alto de electroporación en cerdos destruye irreversiblemente las células objetivo dentro de un rango estrecho mientras que las células vecinas no se ven afectadas, y por lo tanto representa un nuevo tratamiento prometedor para el cáncer, las enfermedades cardíacas y otras enfermedades que requieren la extirpación de tejido. [27] Desde entonces, la electroporación irreversible (IRE) ha demostrado ser eficaz en el tratamiento del cáncer humano, y los cirujanos de Johns Hopkins y otras instituciones ahora utilizan la tecnología para tratar el cáncer de páncreas que anteriormente se creía que era irresecable. [28]
También se informó del primer ensayo clínico de fase I de electrotransferencia génica en pacientes con melanoma metastásico. [29] [30] Se realizó la administración mediada por electroporación de un gen codificante de plásmido para interleucina-12 (pIL-12) y se monitoreó la seguridad, la tolerabilidad y el efecto terapéutico. El estudio concluyó que la electrotransferencia génica con pIL-12 es segura y bien tolerada. Además, también se observó una respuesta parcial o completa en metástasis distantes no tratadas, lo que sugiere el efecto del tratamiento sistémico. Con base en estos resultados, ya están planeando pasar al estudio clínico de fase II. Actualmente hay varios estudios clínicos en curso de electrotransferencia génica [31] donde se monitorea la seguridad, la tolerabilidad y la efectividad de la inmunización con la vacuna de ADN, que se administra mediante pulsos eléctricos.
Aunque el método no es sistémico, sino estrictamente local, sigue siendo la estrategia no viral más eficiente para la administración de genes.
Una técnica reciente llamada electroporación irreversible no térmica (N-TIRE) ha demostrado ser exitosa en el tratamiento de muchos tipos diferentes de tumores y otros tejidos no deseados. Este procedimiento se realiza utilizando pequeños electrodos (de aproximadamente 1 mm de diámetro), colocados dentro o alrededor del tejido objetivo para aplicar ráfagas cortas y repetitivas de electricidad a un voltaje y frecuencia predeterminados. Estas ráfagas de electricidad aumentan el potencial transmembrana en reposo (TMP), de modo que se forman nanoporos en la membrana plasmática. Cuando la electricidad aplicada al tejido está por encima del umbral del campo eléctrico del tejido objetivo, las células se vuelven permanentemente permeables a partir de la formación de nanoporos. Como resultado, las células no pueden reparar el daño y mueren debido a una pérdida de homeostasis. [32] N-TIRE es única en comparación con otras técnicas de ablación de tumores en el sentido de que no crea daño térmico al tejido que lo rodea.
Por el contrario, la electroporación reversible se produce cuando la electricidad aplicada con los electrodos está por debajo del umbral del campo eléctrico del tejido diana. Como la electricidad aplicada está por debajo del umbral de las células, permite que éstas reparen su bicapa de fosfolípidos y continúen con sus funciones celulares normales. La electroporación reversible se realiza normalmente con tratamientos que implican introducir un fármaco o un gen (u otra molécula que normalmente no es permeable a la membrana celular) en la célula. No todos los tejidos tienen el mismo umbral de campo eléctrico; por lo tanto, es necesario realizar cálculos cuidadosos antes de un tratamiento para garantizar la seguridad y la eficacia. [33]
Una de las principales ventajas de utilizar N-TIRE es que, cuando se realiza correctamente según cálculos cuidadosos, solo afecta al tejido diana. Las proteínas, la matriz extracelular y las estructuras críticas como los vasos sanguíneos y los nervios no se ven afectadas y permanecen sanas gracias a este tratamiento. Esto permite una recuperación más rápida y facilita un reemplazo más rápido de las células tumorales muertas por células sanas. [34]
Antes de realizar el procedimiento, los científicos deben calcular cuidadosamente lo que se necesita hacer y tratar a cada paciente de forma individual. Para ello, se utilizan habitualmente tecnologías de diagnóstico por imagen, como tomografías computarizadas y resonancias magnéticas, para crear una imagen tridimensional del tumor. A partir de esta información, pueden aproximar el volumen del tumor y decidir cuál es el mejor curso de acción, incluido el lugar de inserción de los electrodos, el ángulo en el que se insertan, el voltaje necesario y más, mediante tecnología de software. A menudo, se utiliza una máquina de tomografía computarizada para ayudar con la colocación de los electrodos durante el procedimiento, en particular cuando los electrodos se utilizan para tratar tumores en el cerebro. [35]
Todo el procedimiento es muy rápido, y suele durar unos cinco minutos. La tasa de éxito de estos procedimientos es alta [16] y es muy prometedora para el tratamiento futuro en humanos. Una desventaja de utilizar N-TIRE es que la electricidad suministrada por los electrodos puede estimular la contracción de las células musculares, lo que podría tener consecuencias letales según la situación. Por lo tanto, se debe utilizar un agente paralizante al realizar el procedimiento. Los agentes paralizantes que se han utilizado en dichas investigaciones tienen éxito [ cita requerida ] ; sin embargo, siempre existe algún riesgo, aunque leve, al utilizar anestésicos.
Se ha desarrollado una técnica más reciente denominada electroporación irreversible de alta frecuencia (H-FIRE). Esta técnica utiliza electrodos para aplicar ráfagas de electricidad bipolares a alta frecuencia, en lugar de ráfagas de electricidad unipolares a baja frecuencia. Este tipo de procedimiento tiene el mismo éxito de ablación tumoral que el N-TIRE. Sin embargo, tiene una ventaja distintiva: el H-FIRE no provoca contracción muscular en el paciente y, por lo tanto, no es necesario un agente paralizante. [36] Además, se ha demostrado que el H-FIRE produce ablaciones más predecibles debido a la menor diferencia en las propiedades eléctricas de los tejidos a frecuencias más altas. [37]
La electroporación también se puede utilizar para ayudar a administrar medicamentos o genes a la célula mediante la aplicación de pulsos eléctricos cortos e intensos que permeabilizan transitoriamente la membrana celular, permitiendo así el transporte de moléculas que de otro modo no se transportarían a través de una membrana celular. Este procedimiento se conoce como electroquimioterapia cuando las moléculas que se van a transportar son agentes quimioterapéuticos o electrotransferencia génica cuando la molécula que se va a transportar es ADN. Científicos del Instituto Karolinska y la Universidad de Oxford utilizan la electroporación de exosomas para administrar ARNi, oligonucleótidos antisentido, agentes quimioterapéuticos y proteínas específicamente a las neuronas después de inyectarlos sistémicamente (en la sangre). Debido a que estos exosomas pueden atravesar la barrera hematoencefálica , este protocolo podría resolver el problema de la mala administración de medicamentos al sistema nervioso central y potencialmente tratar la enfermedad de Alzheimer , la enfermedad de Parkinson y el cáncer cerebral , entre otras afecciones. [38]
La transformación bacteriana es generalmente la forma más sencilla de producir grandes cantidades de una proteína específica necesaria para fines biotecnológicos o en medicina. Dado que la electrotransferencia de genes es una técnica muy simple, rápida y altamente efectiva, en un principio se convirtió en un reemplazo muy conveniente para otros procedimientos de transformación. [39]
Investigaciones recientes han demostrado que las ondas de choque podrían utilizarse para el pretratamiento de la membrana celular antes de la electroporación. [40] [41] Se ha demostrado que esta estrategia sinérgica reduce el requisito de voltaje externo y crea poros más grandes. Además, la aplicación de ondas de choque permite apuntar al sitio deseado de la membrana. Este procedimiento permite controlar el tamaño del poro.
La electroporación permite la introducción celular de moléculas grandes altamente cargadas, como el ADN , que nunca se difundirían pasivamente a través del núcleo de la bicapa hidrofóbica. [2] Este fenómeno indica que el mecanismo es la creación de agujeros llenos de agua a escala nm en la membrana. [42] Los electroporos se visualizaron ópticamente en modelos de bicapa lipídica como bicapas de interfaz de gotitas [43] y vesículas unilamelares gigantes, [44] mientras que la adición de proteínas del citoesqueleto, como redes de actina, a las vesículas unilamelares gigantes parece prevenir la formación de electroporos visibles. [45] También han surgido evidencias experimentales de redes de actina en la regulación de la permeabilidad de la membrana celular. [46] Aunque la electroporación y la ruptura dieléctrica son resultado de la aplicación de un campo eléctrico, los mecanismos involucrados son fundamentalmente diferentes. En la ruptura dieléctrica, el material de barrera se ioniza, creando una vía conductora. La alteración del material es, por lo tanto, de naturaleza química. Por el contrario, durante la electroporación las moléculas de lípidos no se alteran químicamente sino que simplemente cambian de posición, abriendo un poro que actúa como vía conductora a través de la bicapa mientras se llena de agua.
La electroporación es un fenómeno dinámico que depende del voltaje transmembrana local en cada punto de la membrana celular. En general, se acepta que para una duración y forma de pulso dadas, existe un umbral de voltaje transmembrana específico para la manifestación del fenómeno de electroporación (de 0,5 V a 1 V). Esto conduce a la definición de un umbral de magnitud de campo eléctrico para la electroporación (E th ). Es decir, solo las células dentro de las áreas donde E ≧ E th son electroporadas. Si se alcanza o supera un segundo umbral (E ir ), la electroporación comprometerá la viabilidad de las células, es decir , electroporación irreversible (IRE). [47]
La electroporación es un proceso de varios pasos con varias fases distintas. [48] [49] Primero, se debe aplicar un pulso eléctrico corto. Los parámetros típicos serían 300–400 mV durante < 1 ms a través de la membrana (nota: los voltajes utilizados en experimentos celulares son típicamente mucho mayores porque se aplican a través de grandes distancias a la solución en masa, por lo que el campo resultante a través de la membrana real es solo una pequeña fracción del sesgo aplicado). Tras la aplicación de este potencial, la membrana se carga como un condensador a través de la migración de iones desde la solución circundante. Una vez que se alcanza el campo crítico, hay una rápida reorganización localizada en la morfología de los lípidos. Se cree que la estructura resultante es un "preporo", ya que no es eléctricamente conductor, pero conduce rápidamente a la creación de un poro conductor. [50] La evidencia de la existencia de tales preporos proviene principalmente del "parpadeo" de los poros, lo que sugiere una transición entre estados conductores y aislantes. [51] Se ha sugerido que estos preporos son defectos hidrófobos pequeños (~3 Å). Si esta teoría es correcta, entonces la transición a un estado conductor podría explicarse por una reorganización en el borde del poro, en el que las cabezas lipídicas se pliegan para crear una interfaz hidrófila. Finalmente, estos poros conductores pueden curarse, volviendo a sellar la bicapa, o expandirse, y eventualmente romperla. El destino resultante depende de si se excedió el tamaño crítico del defecto [52], lo que a su vez depende del campo aplicado, la tensión mecánica local y la energía del borde de la bicapa.
La aplicación de pulsos eléctricos de suficiente fuerza a la célula provoca un aumento en la diferencia de potencial transmembrana, lo que provoca la desestabilización de la membrana. La permeabilidad de la membrana celular aumenta y las moléculas no permeables entran en la célula. [53] [54] Aunque los mecanismos de electrotransferencia de genes aún no se comprenden completamente, se ha demostrado que la introducción de ADN solo ocurre en la parte de la membrana que mira hacia el cátodo y que se necesitan varios pasos para una transfección exitosa: migración electroforética de ADN hacia la célula, inserción de ADN en la membrana, translocación a través de la membrana, migración de ADN hacia el núcleo, transferencia de ADN a través de la envoltura nuclear y finalmente expresión génica. [55] Hay una serie de factores que pueden influir en la eficiencia de la electrotransferencia de genes, como: temperatura, parámetros de pulsos eléctricos, concentración de ADN, tampón de electroporación utilizado, tamaño celular y la capacidad de las células para expresar genes transfectados. [56] En la electrotransferencia de genes in vivo , la difusión de ADN a través de la matriz extracelular, las propiedades del tejido y la conductividad tisular general también son cruciales. [57]
En la década de 1960 se sabía que aplicando un campo eléctrico externo se podía crear un gran potencial de membrana en los dos polos de una célula. En la década de 1970 se descubrió que cuando un potencial de membrana alcanzaba un nivel crítico, la membrana se descomponía y podía recuperarse. [58] En la década de 1980, esta abertura se utilizaba para introducir diversos materiales/moléculas en las células. [59]