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Nucleasa con dedos de zinc

Las nucleasas con dedos de zinc ( ZFN ) son enzimas de restricción artificiales generadas mediante la fusión de un dominio de unión al ADN con dedos de zinc con un dominio de escisión del ADN . Los dominios con dedos de zinc se pueden diseñar para apuntar a secuencias de ADN específicas deseadas y esto permite que las nucleasas con dedos de zinc se dirijan a secuencias únicas dentro de genomas complejos . Aprovechando la maquinaria endógena de reparación del ADN, estos reactivos pueden usarse para alterar con precisión los genomas de organismos superiores. Junto con CRISPR/Cas9 y TALEN , ZFN es una herramienta destacada en el campo de la edición del genoma .

Dominios

dominio de unión al ADN

Los dominios de unión al ADN de las ZFN individuales suelen contener entre tres y seis repeticiones de dedos de zinc individuales y cada uno puede reconocer entre 9 y 18 pares de bases. Si los dominios de dedos de zinc reconocen perfectamente una secuencia de ADN de 3 pares de bases, pueden generar una matriz de 3 dedos que puede reconocer un sitio objetivo de 9 pares de bases. Otros procedimientos pueden utilizar módulos de 1 o 2 dedos para generar matrices de dedos de zinc con seis o más dedos de zinc individuales. El principal inconveniente de este procedimiento es que las especificidades de los dedos de zinc individuales pueden superponerse y depender del contexto de los dedos de zinc y del ADN circundantes. Sin métodos que tengan en cuenta esta "dependencia del contexto", el procedimiento de ensamblaje modular estándar a menudo falla. [1]

Se han utilizado numerosos métodos de selección para generar matrices de dedos de zinc capaces de apuntar a secuencias deseadas. Los esfuerzos de selección iniciales utilizaron la presentación de fagos para seleccionar proteínas que se unían a un objetivo de ADN determinado de un gran conjunto de matrices de dedos de zinc parcialmente aleatorias. Esfuerzos más recientes han utilizado sistemas de un híbrido de levadura, sistemas bacterianos de un híbrido y dos híbridos y células de mamíferos. Un nuevo método prometedor para seleccionar nuevas matrices de dedos de zinc utiliza un sistema bacteriano de dos híbridos y sus creadores lo han denominado "ABIERTO". [2] Este sistema combina grupos preseleccionados de dedos de zinc individuales, cada uno de los cuales fue seleccionado para unirse a un triplete determinado y luego utiliza una segunda ronda de selección para obtener matrices de 3 dedos capaces de unirse a una secuencia deseada de 9 pb. Este sistema fue desarrollado por el Zinc-Finger Consortium como una alternativa a las fuentes comerciales de conjuntos de dedos de zinc diseñados.

(ver: Quimera de dedos de zinc para obtener más información sobre las técnicas de selección de dedos de zinc)

dominio de escisión de ADN

Se muestra un par de ZFN, cada uno con tres dedos de zinc que se unen al ADN objetivo, introduciendo una rotura de doble hebra en el dominio FokI, representado en amarillo. Posteriormente, se muestra que la rotura de doble cadena se repara mediante reparación dirigida por homología o unión de extremos no homólogos . [3]

El dominio de escisión no específico de la endonucleasa de restricción FokI de tipo II se utiliza normalmente como dominio de escisión en las ZFN. [4] Este dominio de escisión debe dimerizarse para escindir el ADN [5] y, por lo tanto, se requiere un par de ZFN para apuntar a sitios de ADN no palindrómicos. Las ZFN estándar fusionan el dominio de escisión con el extremo C de cada dominio de dedos de zinc. Para permitir que los dos dominios de escisión dimericen y escindan el ADN, los dos ZFN individuales deben unirse a hebras opuestas de ADN con sus extremos C a cierta distancia. Las secuencias conectoras más comúnmente utilizadas entre el dominio de dedos de zinc y el dominio de escisión requieren que el borde 5' de cada sitio de unión esté separado por 5 a 7 pb. [6]

Se han empleado varias técnicas diferentes de ingeniería de proteínas para mejorar tanto la actividad como la especificidad del dominio de nucleasa utilizado en las ZFN. Se ha empleado la evolución dirigida para generar una variante de FokI con actividad de escisión mejorada que los autores denominaron "Sharkey". [7] También se ha empleado un diseño basado en la estructura para mejorar la especificidad de escisión de FokI modificando la interfaz de dimerización para que solo las especies heterodiméricas deseadas estén activas. [8] [9] [10] [11]

Aplicaciones

Las nucleasas de dedos de zinc son útiles para manipular los genomas de muchas plantas y animales, incluidos arabidopsis , [12] [13] tabaco , [14] [15] soja , [16] maíz , [17] Drosophila melanogaster , [18] C. elegans. , [19] Platynereis dumerilii , [20] erizo de mar , [21] gusano de seda , [22] pez cebra , [23] ranas , [24] ratones , [25] ratas , [26] conejos , [27] cerdos , [28 ] ganado , [29] y varios tipos de células de mamíferos. [30] Las nucleasas con dedos de zinc también se han utilizado en un modelo de ratón con hemofilia [31] y un ensayo clínico encontró que las células T humanas CD4+ con el gen CCR5 alterado por las nucleasas con dedos de zinc son seguras como tratamiento potencial para el VIH/SIDA . [32] Las ZFN también se utilizan para crear una nueva generación de modelos de enfermedades genéticas llamados modelos de enfermedades humanas isogénicas .

Deshabilitar un alelo

Las ZFN se pueden utilizar para desactivar mutaciones dominantes en individuos heterocigotos produciendo roturas de doble hebra (DSB) en el ADN (ver Recombinación genética ) en el alelo mutante, que, en ausencia de una plantilla homóloga, será reparada por no homólogas. unión de extremos (NHEJ). NHEJ repara los DSB uniendo los dos extremos y generalmente no produce mutaciones, siempre que el corte sea limpio y sin complicaciones. En algunos casos, sin embargo, la reparación es imperfecta, lo que resulta en la eliminación o inserción de pares de bases, lo que produce un cambio de marco y previene la producción de la proteína dañina. [33] También se pueden utilizar múltiples pares de ZFN para eliminar por completo grandes segmentos completos de secuencia genómica. [34] Para monitorear la actividad de edición, una PCR del área objetivo amplifica ambos alelos y, si uno contiene una inserción, eliminación o mutación, da como resultado una burbuja monocatenaria heterodúplex que los ensayos de escisión pueden detectar fácilmente. Las ZFN también se han utilizado para modificar alelos que causan enfermedades en trastornos de repetición de tripletes. Los tractos repetidos CAG/CTG expandidos son la base genética de más de una docena de trastornos neurológicos hereditarios, incluida la enfermedad de Huntington, la distrofia miotónica y varias ataxias espinocerebelosas. Se ha demostrado en células humanas que las ZFN pueden dirigir roturas de doble hebra (DSB) a repeticiones CAG y reducir la repetición de longitudes patológicas largas a longitudes cortas y menos tóxicas. [35]

Recientemente, un grupo de investigadores ha aplicado con éxito la tecnología ZFN para modificar genéticamente el gen del pigmento gol y el gen ntl en embriones de pez cebra. Se diseñaron motivos específicos de dedos de zinc para reconocer distintas secuencias de ADN. El ARNm que codifica ZFN se inyectó en embriones unicelulares y un alto porcentaje de animales portaban las mutaciones y fenotipos deseados. Su trabajo de investigación demostró que las ZFN pueden crear de manera específica y eficiente alelos mutantes hereditarios en loci de interés de la línea germinal, y que los alelos inducidos por ZFN pueden propagarse en generaciones posteriores.

Otros grupos de investigación también han llevado a cabo investigaciones similares sobre el uso de ZFN para crear mutaciones específicas en embriones de pez cebra. El gen kdr del pez cebra codifica el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2. Un grupo de investigadores de EE. UU. indujeron lesiones mutagénicas en este sitio objetivo mediante la técnica ZFN. Sugirieron que la técnica ZFN permite la generación sencilla de una serie alélica específica de mutantes; no depende de la existencia de líneas de células madre embrionarias específicas de cada especie y es aplicable a otros vertebrados, especialmente aquellos cuyos embriones son fácilmente disponibles; Finalmente, también es factible lograr efectos específicos en el pez cebra, por lo que es posible crear modelos de enfermedades humanas que hasta ahora son inaccesibles.

Edición de alelos

Las ZFN también se utilizan para reescribir la secuencia de un alelo invocando la maquinaria de recombinación homóloga (HR) para reparar el DSB utilizando el fragmento de ADN suministrado como plantilla. La maquinaria HR busca homología entre el cromosoma dañado y el fragmento extracromosómico y copia la secuencia del fragmento entre los dos extremos rotos del cromosoma, independientemente de si el fragmento contiene la secuencia original. Si el sujeto es homocigoto para el alelo objetivo, la eficacia de la técnica se reduce ya que la copia intacta del alelo puede usarse como plantilla para la reparación en lugar del fragmento suministrado.

Terapia de genes

El éxito de la terapia génica depende de la inserción eficiente de genes terapéuticos en un sitio cromosómico objetivo apropiado dentro del genoma humano , sin causar daño celular, mutaciones oncogénicas o una respuesta inmune . La construcción de vectores plásmidos es simple y directa. Las ZFN diseñadas a medida que combinan el dominio de escisión no específico (N) de la endonucleasa Fok I con proteínas con dedos de zinc (ZFP) ofrecen una forma general de entregar un DSB específico de sitio al genoma y estimular la recombinación homóloga local en varios órdenes. de magnitud. Esto hace que la corrección genética dirigida o la edición del genoma sea una opción viable en las células humanas. Dado que los plásmidos que codifican ZFN podrían usarse para expresar transitoriamente ZFN para dirigir un DSB a un locus genético específico en células humanas, ofrecen una manera excelente para la administración dirigida de genes terapéuticos a un sitio cromosómico preseleccionado. El enfoque basado en plásmidos que codifican ZFN tiene el potencial de sortear todos los problemas asociados con la administración viral de genes terapéuticos. [36] Es probable que las primeras aplicaciones terapéuticas de las ZFN impliquen una terapia ex vivo utilizando las propias células madre del paciente. Después de editar el genoma de las células madre, las células podrían expandirse en cultivo y reinsertarse en el paciente para producir células diferenciadas con funciones corregidas. Los objetivos iniciales probablemente incluyan las causas de enfermedades monogénicas, como el gen IL2Rγ y el gen de la β-globina para la corrección genética y el gen CCR5 para la mutagénesis y la discapacidad. [33]

Problemas potenciales

Escisión fuera del objetivo

Si los dominios de dedos de zinc no son lo suficientemente específicos para su sitio objetivo o no se dirigen a un sitio único dentro del genoma de interés, puede ocurrir una escisión fuera del objetivo. Esta escisión fuera del objetivo puede conducir a la producción de suficientes roturas de doble cadena como para abrumar la maquinaria de reparación y, como consecuencia, producir reordenamientos cromosómicos y/o muerte celular. Los eventos de escisión fuera del objetivo también pueden promover la integración aleatoria del ADN del donante. [33] Se ha demostrado que dos métodos separados disminuyen la escisión fuera del objetivo para ZFN de 3 dedos que se dirigen a dos sitios adyacentes de 9 pares de bases. [37] Otros grupos utilizan ZFN con 4, 5 o 6 dedos de zinc que apuntan a sitios más largos y presumiblemente más raros y, en teoría, tales ZFN podrían producir menos actividad fuera del objetivo. Una comparación de un par de ZFN de 3 dedos y un par de ZFN de 4 dedos detectó escisión fuera del objetivo en células humanas en 31 loci para las ZFN de 3 dedos y en 9 loci para las ZFN de 4 dedos. [38] La secuenciación del genoma completo de C. elegans modificado con un par de ZFN de 5 dedos encontró solo la modificación deseada y una eliminación en un sitio "no relacionado con el sitio ZFN", lo que indica que este par de ZFN era capaz de apuntar a un sitio único en el genoma de C. elegans . [19]

Inmunogenicidad

Como ocurre con muchas proteínas extrañas insertadas en el cuerpo humano, existe el riesgo de que se produzca una respuesta inmunológica contra el agente terapéutico y las células en las que está activo. Sin embargo, dado que la proteína debe expresarse sólo de forma transitoria, el tiempo durante el cual se puede desarrollar una respuesta es corto. [33]

Liu y cols. Las ZFNickases dirigidas respectivamente al locus endógeno de b-caseína (CSN2) estimulan la adición de genes de lisostafina y lisozima humana mediante reparación dirigida por homología y derivan vacas secretas de lisostafina. [39] [40]

Perspectivas

La capacidad de manipular con precisión los genomas de plantas y animales tiene numerosas aplicaciones en la investigación básica, la agricultura y la terapéutica humana. El uso de ZFN para modificar genes endógenos ha sido tradicionalmente una tarea difícil debido principalmente al desafío de generar dominios con dedos de zinc que se dirijan a la secuencia deseada con suficiente especificidad. Los métodos mejorados de ingeniería de dominios de dedos de zinc y la disponibilidad de ZFN de un proveedor comercial ahora ponen esta tecnología en manos de un número cada vez mayor de investigadores. Varios grupos también están desarrollando otros tipos de nucleasas diseñadas, incluidas endonucleasas dirigidas diseñadas [41] [42] y nucleasas basadas en efectores TAL diseñados . [43] [44] Las nucleasas efectoras TAL (TALEN) son particularmente interesantes porque los efectores TAL parecen ser muy fáciles de diseñar [45] [46] y las TALEN pueden usarse para apuntar a loci endógenos en células humanas. [47] Pero hasta la fecha nadie ha informado del aislamiento de líneas celulares clonales u organismos transgénicos utilizando tales reactivos. Se ha probado un tipo de ZFN, conocido como SB-728-T, para su posible aplicación en el tratamiento del VIH. [48]

Nickasas con dedos de zinc

Las nickasas con dedos de zinc (ZFNickases) se crean inactivando la actividad catalítica de un monómero ZFN en el dímero ZFN necesario para la escisión de la doble hebra. [49] Las ZFNickasas demuestran actividad de mellado específica de la cadena in vitro y, por lo tanto, proporcionan roturas monocatenarias altamente específicas en el ADN. [49] Estos SSB se someten a los mismos mecanismos celulares para el ADN que explotan los ZFN, pero muestran una frecuencia significativamente reducida de reparaciones mutagénicas de NHEJ en su sitio de mellado objetivo. Esta reducción proporciona un sesgo para las modificaciones genéticas mediadas por HR. Las ZFNickases pueden inducir HR dirigida en células humanas y de ganado cultivadas, aunque en niveles más bajos que las ZFN correspondientes de las que se derivaron, porque las mellas pueden repararse sin alteración genética. [39] [50] Una limitación importante de las modificaciones genéticas mediadas por ZFN es la competencia entre las vías de reparación NHEJ y HR. Independientemente de la presencia de una construcción donante de ADN, ambos mecanismos de reparación pueden activarse después de las DSB inducidas por las ZFN. Por lo tanto, ZFNickases es el primer intento plausible de diseñar un método que favorezca el método HR de reparación del ADN en lugar de la reparación NHEJ, propensa a errores. Al reducir las reparaciones de NHEJ, las ZFNickases pueden reducir el espectro de alteraciones no deseadas no deseadas. La facilidad con la que se pueden derivar ZFNickases a partir de ZFN proporciona una gran plataforma para estudios adicionales sobre la optimización de ZFNickases y posiblemente aumentar sus niveles de HR objetivo mientras se mantiene su frecuencia NHEJ reducida.

Ver también

Referencias

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