Fillion ha actuado en películas distribuidas tradicionalmente como Slither y Trucker, películas distribuidas por Internet como Dr. Horrible's Sing-Along Blog, telenovelas, comedias de situación y teatro.

Fillion obtuvo reconocimiento por primera vez por su trabajo en One Life to Live en el papel contratado de Joey Buchanan, por el que fue nominado al premio Daytime Emmy como actor joven destacado en una serie dramática, así como por su papel secundario como Johnny Donnelly en la comedia Two Guys and a Girl.

[9]​ Después de trabajar en varias producciones de teatro, televisión y cine, incluyendo Theatresports con Rapid Fire Theatre y la telenovela improvisada Die-Nasty, Fillion se mudó a la ciudad de Nueva York en 1994, donde actuó en la telenovela One Life to Live como Joey Buchanan.

por la que fue nominado en 1996 al premio Daytime Emmy como actor joven destacado en una serie dramática.

En 1997, dejó la serie para dedicarse a otros proyectos (regresó para una breve aparición como invitado en 2007).

– Premio masculino de la Academy of Science Fiction, Fantasy & Horror Films, Estados Unidos.

[16]​ Fillion prestó su voz para la serie animada King of the Hill en 2001, el videojuego Jade Empire (como la voz de Gao the Lesser) y la serie animada Justice League Unlimited (como Vigilante en los episodios "Hunter's Moon" y "Patriot Ley") en 2005-2006.

Por su papel protagónico como Bill Pardy, obtuvo una nominación a los premios Fangoria Chainsaw Awards en 2006 en la categoría de Amigo con el que no quieres meterte.

Ivan Sergei interpretó a Alex Tully en el episodio piloto original de Drive .

[43]​ Interpretó a Dogberry en la película independiente Much Ado About Nothing (2012), basada en la obra de Shakespeare del mismo nombre, escrita, dirigida y producida por Joss Whedon .

[44]​ [45]​ Desde 2011, Fillion ha aparecido como el personaje recurrente del Space Western Cactoid Jim en presentaciones del programa en vivo podcasted The Thrilling Adventure Hour, un espectáculo teatral que se basa en la idea de que los actores actúan como personajes en un programa de radio.

El personaje de Cactoid Jim apareció por primera vez como parte del segmento recurrente "Sparks Nevada, Marshal on Mars", pero pronto se le dio su propio segmento, llamado "Cactoid Jim: King of the Martian Frontier".

Durante los años siguientes, su papel se hizo mayor con las expansiones del juego.

Fillion volvió al papel en la secuela de 2017, Destiny 2, y ocupó un lugar destacado en el juego hasta el lanzamiento de Forsaken, donde Nolan North le dio voz al personaje hasta su muerte.

Pero pensé que sería interesante empezar con un hombre blanco de mandíbula cuadrada y Nathan Fillion aceptó participar".

[62]​ En 2007, Fillion y el autor PJ Haarsma cofundaron la organización sin fines de lucro Kids Need to Read, para ayudar a inspirar la imaginación de los niños al conseguir más libros en bibliotecas con fondos insuficientes.