[3]​ Al igual que otros antibióticos betalactámicos la nafcilina actúa inhibiendo la síntesis de la pared celular bacteriana.

La nafcilina y otros antibíoticos betalactámicos son análogos estructurales de la D-alanil-alanina, y las enzimas transpeptidasas que se unen a ella, son llamadas «proteínas de unión a la penicilina» (PUP).

La nafcilina se indica en el tratamiento de infecciones por estafilococos, excepto las causadas por cepas resistentes a la meticilina.

[3]​ La nafcilina es la primera opción en el tratamiento de la endocarditis causada por estafilococos en pacientes que no tengan válvulas cardíacas artificiales.

[4]​ La nafcilina se indica también en el tratamiento de la mastitis y osteomielitis, en cuyos casos el principal agente causal es el Staphylococcus aureus.