[3]​ Durante su tiempo en el Ultimate Fighting Championship, Hughes obtuvo dos rachas separadas de seis victorias consecutivas, derrotó a toda la oposición disponible en la división de peso welter y defendió el cinturón en siete ocasiones, un récord en ese momento.

[8]​ En 2008, Hughes publicó su autobiografía, Made in America, que llegó a la lista de bestsellers del New York Times.

En la tercera pelea de esa noche perdió ante el entonces invicto Dennis Hallman por sumisión técnica (mataleón) a los 0:17 del primer asalto, aunque el resultado se anunció como un KO.

En WEF 9: World Class, Hughes venció a Alexandre Barros por decisión unánime en una pelea emocionante que duró los tres asaltos completos.

[19]​ Tan solo 20 días después tuvo otro combate, esta vez en el evento Extreme Challenge 35, donde venció a Joe Guist por sumisión en el primer asalto.

Ganó sus siguientes tres combates, incluyendo una victoria por decisión unánime contra Chris Haseman en Rings: Millennium Combine 3 en agosto del 2000 en Osaka, Japón.

En UFC 29: Defense of the Belts, Hughes se enfrentó a Dennis Hallman en una revancha,[20]​ ya que Hallman era el único hombre que había derrotado a Hughes en competición de MMA en ese momento.

Aunque Sakurai logró lanzar un golpe de derecha que hizo que Hughes cayera al suelo en el segundo asalto, Hughes ganó el asalto al pasar tres minutos golpeando a Sakurai desde una posición superior.

Hughes terminó la pelea en el cuarto asalto, al derribar a Sakurai y lograr una posición de montada completa.

Una vez más, Hughes salió victorioso al conseguir un nocaut técnico al atrapar a Newton en una posición de crucifijo modificada, lo que le permitió golpear la cara de Newton sin respuesta hasta que el árbitro detuvo el combate a los 3:27 del cuarto asalto.

En su siguiente defensa del título, Hughes luchó contra Gil Castillo en UFC 40: Vendetta, derrotándole por TKO.

Hughes dominó gran parte del combate, consiguiente atacar desde la guardia de Castillo con codos y puñetazos.

En UFC 42: Sudden Impact, Hughes se enfrentó a Sean Sherk en una pelea por el campeonato de peso wélter.

Hughes dominó la pelea con su habilidad para derribar a Sherk y controlar la lucha en el suelo.

Aunque Sherk logró derribar a Hughes en un par de ocasiones, el campeón demostró una defensa sólida y se recuperó rápidamente.

[28]​ El estrangulamiento le valió a Hughes el premio Tapout of the Night Submission Award.

En un combate competitivo, Hughes logró someter a St-Pierre mediante una palanca de brazo en los últimos segundos del primer asalto.

A pesar de enfrentar dificultades al comienzo del combate, Hughes demostró su habilidad para recuperarse y salir victorioso.

El combate se trasladó rápidamente al suelo, donde Trigg intentó someter a Hughes con una estrangulación trasera.

La siguiente pelea de Hughes tuvo lugar en UFC 56: Full Force, donde estaba programado para enfrentarse al judoca Karo Parisyan.

Sin embargo, debido a una lesión en el tendón de la corva, Parisyan no pudo pelear, por lo que Joe Riggs tomó su lugar.

La llave de brazo le valió a Hughes su último premio "Tapout of the Night".

En el tercer asalto, Penn mostró signos de fatiga y no pudo mantener el ritmo inicial.

En una entrevista en el sitio web personal de Penn, este afirmó que para el tercer asalto apenas podía respirar y no tenía "movilidad en su zona abdominal".

Tras el suceso, trabajaron con la Fundación Triumph Over Tragedy para determinar los próximos pasos de atención.