[3]​ En 1837, con ocho años, Joseph actuaba en el Teatro Franklin de Nueva York junto a sus padres.

[11]​ Tras esta experiencia, en la que trabajó como actor y director teatral, tuvo también un prolongado éxito en 1858 como Asa Trenchard en la obra de Tom Taylor Our American Cousin, representada en el Teatro de Laura Keene en Nueva York.

Joseph Jefferson también hizo varias grabaciones, siempre con material de "Rip Van Winkle".

Tuvo amistad con muchos destacados hombres de la política, el arte y la literatura estadounidense, incluyendo al Presidente Grover Cleveland.

Jefferson fue además miembro fundador y segundo presidente del The Players de Manhattan.

Jefferson se casó dos veces: en 1850, a los 21 años de edad, con la actriz Margaret Clements Lockyer (1832–1861), cuya temprana muerte le dejó con cuatro hijos; en 1867 se casó con Sarah Warren, sobrina del actor William Warren.

Jefferson compró un lugar llamado Orange Island, en Louisiana, donde construyó una casa un avez acabada la Guerra de Secesión.

El lugar, en un área peninsular en Lake Peigneur, fue posteriormente llamado Jefferson Island.