Es hijo de James Williams, pastor protestante, y Margaret Lynn, trabajadora social.

Luego se unió al grupo de teatro en el Instituto Davis, actuando en muchas obras, incluyendo musicales.

Fue notable y aclamada su actuación como Spike en la serie de televisión Buffy, la cazavampiros, apareciendo por primera vez en la segunda temporada, donde atrajo la atención del gran público.

Spike se convirtió en un personaje fijo en la cuarta temporada, y permaneció así hasta el final de la serie.

Se inspiró para su acento inglés de Spike en Anthony Stewart Head, quien interpretaba al bibliotecario y vigilante Rupert Giles.

Aparte del papel que interpretó, Marsters también escribió un cómic, Buffy the Vampire Slayer: Spike and Dru.

Marsters coprotagonizó la película de 2007, Posdata, te amo, junto a Hilary Swank, Gerard Butler y Kathy Bates.

El 18 de septiembre del mismo año, Marsters informó de que participaría en la película animada Superman: El día del juicio final, proporcionando la voz al icónico villano Lex Luthor.

La película recibió críticas sobre todo positivas, con la mayor parte de los críticos y admiradores declarando que Marsters y su coprotagonista, Adam Baldwin (quien dio voz a Superman), habían cumplido con sus papeles.

Además, cantó varias canciones en el episodio musical de Buffy, la cazavampiros "Once More, with Feeling".

Entre 2003 y 2004, Marsters fue el vocalista del grupo de rock Ghost of the Robot.

"Birth of the Blues" fue compuesta por Marsters en Ámsterdam en 2004 viajando con su ahora desaparecida banda.

Durante su miniviaje en octubre de 2005 al Reino Unido, Marsters introdujo otras nuevas canciones a su repertorio: "Button Down Vandals", "Up On Me" y "All That She Wanted".

Durante un concierto de septiembre de 2006, "James Marsters & Friends", Marsters estrenó varias canciones nuevas, incluyendo "The Truth Is Heavy", "Fall of Night", "Jealous Man" y "Not a Millionaire".

Todas estas canciones reflejaban su nuevo estilo de música blues y sonido folk.

Todas escritas por Marsters, fueron tocadas y registradas en vivo, no en el estudio.