Hartline empezó sus estudios sobre electrofisiología de la retina como un becario del "National Research Council Fellow" en la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, recibiendo su M.D.

Hartline se unió al staff de la Universidad Rockefeller, Nueva York, en 1953, como profesor de neurofisiología.

Hartline investigó las respuestas eléctricas de la retina de ciertos artrópodos, vertebrados, y moluscos, debido a que sus sistemas visuales son mucho más simples que los de los humanos y es más fácil estudiarlos.

Concentró sus estudios en el ojo del cangrejo herradura (Limulus polyphemus).

Usando electrodos de minute en sus experimentos, obtuvo el primer registro de los impulsos eléctricos enviados por una simple fibra de nervio óptico cuando los receptores conectados a ésta son estimulados por luz.