Voltamperometría de película de proteínas

Método de análisis químico

En electroquímica , la voltamperometría de película de proteínas (o electroquímica de película de proteínas o electroquímica directa de proteínas ) es una técnica para examinar el comportamiento de las proteínas inmovilizadas (ya sea adsorbidas o unidas covalentemente) en un electrodo . La técnica es aplicable a proteínas y enzimas que participan en reacciones de transferencia de electrones y es parte de los métodos disponibles para estudiar la cinética enzimática . ^{[ cita requerida ]}

Siempre que haga contacto adecuado con la superficie del electrodo (la transferencia de electrones entre el electrodo y la proteína es directa) y que no esté desnaturalizada , la proteína puede ser interrogada de manera fructífera monitoreando la corriente en función del potencial del electrodo y otros parámetros experimentales.

Se pueden utilizar diversos materiales de electrodos. ^[1] Se requieren diseños de electrodos especiales para abordar las proteínas unidas a la membrana. ^[2]

Experimentos con proteínas redox

Se pueden investigar pequeñas proteínas redox, como los citocromos y las ferredoxinas, siempre que su cobertura electroactiva (la cantidad de proteína que experimenta una transferencia directa de electrones) sea lo suficientemente grande (en la práctica, mayor que una fracción de pmol/cm ² ).

Los datos electroquímicos obtenidos con proteínas pequeñas se pueden utilizar para medir los potenciales redox de los sitios redox de la proteína, ^[3] la tasa de transferencia de electrones entre la proteína y el electrodo, ^[4] o las tasas de reacciones químicas (como protonaciones) que están acopladas a la transferencia de electrones. ^[5]

Interpretación de la corriente pico y del área pico

Fig. 1. Señales voltamétricas para una especie redox de un electrón (A) o dos electrones (B) adsorbida sobre un electrodo en el límite de velocidad de barrido lenta. La corriente representada aquí está normalizada por , lo que implica que la corriente medida aumenta en proporción a la velocidad de barrido ( ). ${\displaystyle F^{2}\nu A\Gamma /RT}$ ${\displaystyle \nu }$

Fig. 2. Efecto de la velocidad de barrido en la voltamperometría de una especie redox de un electrón adsorbida en un electrodo (la corriente que se muestra aquí está normalizada por , lo que implica que la corriente medida aumenta en proporción a la velocidad de barrido ( )) calculada para , K. La velocidad de barrido aumenta de azul a rojo. A: voltamogramas. B: potenciales pico ${\displaystyle F^{2}\nu A\Gamma /RT}$ ${\displaystyle \nu }$ ${\displaystyle \alpha =0.5}$ ${\displaystyle T=298}$

En un experimento de voltametría cíclica realizado con una proteína redox adsorbida, la oxidación y reducción de cada sitio redox se muestra como un par de picos positivos y negativos. Dado que toda la muestra se oxida o se reduce durante el barrido de potencial, la corriente de pico y el área de pico deberían ser proporcionales a la velocidad de barrido (observar que la corriente de pico es proporcional a la velocidad de barrido demuestra que la especie redox que da el pico está realmente inmovilizada). ^[3] Lo mismo es cierto para los experimentos realizados con moléculas redox no biológicas adsorbidas en electrodos. La teoría fue desarrollada principalmente por el electroquímico francés Etienne Laviron en la década de 1980 ^{[4] , [6] ,} . ^[7]

Dado que tanto esta corriente faradaica (que resulta de la oxidación/reducción de la molécula adsorbida) como la corriente capacitiva (que resulta de la carga del electrodo) aumentan en proporción a la velocidad de barrido, los picos deberían permanecer visibles cuando se aumenta la velocidad de barrido. Por el contrario, cuando el analito redox está en solución y se difunde hacia/desde el electrodo, la corriente pico es proporcional a la raíz cuadrada de la velocidad de barrido (véase: ecuación de Randles-Sevcik ).

Área de pico

Independientemente de la velocidad de exploración, el área bajo el pico (en unidades de AV) es igual a , donde es el número de electrones intercambiados en la oxidación/reducción del centro, es la superficie del electrodo y es la cobertura electroactiva (en unidades de mol/cm ² ). ^[3] Por lo tanto, esto último se puede deducir del área bajo el pico después de restar la corriente capacitiva . ${\displaystyle nFA\Gamma \nu }$ ${\displaystyle n}$ ${\displaystyle A}$ ${\displaystyle \Gamma }$

Forma de pico

Velocidad de escaneo lenta

A velocidades de escaneo lentas no debería haber separación entre los picos oxidativos y reductores.

• Un sitio de un solo electrón (por ejemplo, un grupo de hemo o FeS) da un pico ancho (fig. 1A). La ecuación que da la forma e intensidad del pico es:

${\displaystyle {\frac {i}{F^{2}\nu A\Gamma /RT}}=\pm {\frac {\exp \left({\frac {F}{RT}}(E-E^{0})\right)}{(1+\exp \left({\frac {F}{RT}}(E-E^{0})\right)^{2}}}}$

Lo ideal es que la posición del pico esté en ambas direcciones. La corriente de pico es (es proporcional a la velocidad de barrido, , y a la cantidad de sitios redox en el electrodo, ). El ancho ideal a la mitad de la altura (HWHH) equivale a mV a 20 °C. Un comportamiento no ideal puede provocar que el pico sea más ancho que el límite ideal. ${\displaystyle E_{p}=E^{0}}$ ${\displaystyle i_{p}=F^{2}\nu A\Gamma /4RT}$ ${\displaystyle \nu }$ ${\displaystyle A\Gamma }$ ${\displaystyle RT/F\times \ln(3+2{\sqrt {2}})=89}$

• La forma del pico de un sitio redox de dos electrones (por ejemplo, una flavina ) depende de la estabilidad del estado semirreducido (fig. 1B). Si el estado semirreducido es estable en un amplio rango de potencial de electrodo, la señal es la suma de dos picos de un electrón (línea violeta en la fig. 1B). Si el estado semirreducido es inestable, la señal es un solo pico (línea roja en la fig. 1B), que puede tener hasta cuatro veces la altura y la mitad del ancho de un pico de un electrón. ^{[6] , [8]}
• Una proteína que contiene múltiples centros redox debería producir múltiples picos que tengan todos la misma área (escalada por ). ${\displaystyle n}$

Velocidades de escaneo rápidas

Si la reacción es una reacción de transferencia de electrones simple, los picos deben permanecer simétricos a velocidades de barrido rápidas. Se observa una separación de picos cuando la velocidad de barrido , donde es la constante de velocidad de transferencia de electrones de intercambio en la teoría de Butler Volmer . La ecuación de Laviron ^{[4] , [8] , [9]} predice que a velocidades de barrido rápidas, los picos se separan en proporción a . Cuanto mayor o menor , mayor es la separación de picos. Los potenciales de pico son , ^[4] como se muestra mediante líneas en la figura 2B ( es el coeficiente de transferencia de carga ). Por lo tanto, examinar el cambio experimental en la posición del pico frente a la velocidad de barrido informa sobre la velocidad de transferencia de electrones interfacial . ${\displaystyle \nu \gg RTk^{0}/F}$ ${\displaystyle k_{0}}$ ${\displaystyle \log(\nu /k^{0})}$ ${\displaystyle \nu }$ ${\displaystyle k^{0}}$ ${\displaystyle E_{p}=E^{0}\pm {\frac {RT}{\alpha F}}\ln {\frac {\alpha F\nu }{k^{0}RT}}}$ ${\displaystyle \alpha }$ ${\displaystyle k^{0}}$

Efecto de las reacciones químicas acopladas

Las reacciones acopladas son aquellas cuya velocidad o constante de equilibrio no es la misma para las formas oxidada y reducida de la especie que se está investigando. Por ejemplo, la reducción debería favorecer la protonación ( ): la reacción de protonación está acoplada a la reducción en . La unión de una molécula pequeña (que no sea el protón) también puede estar acoplada a una reacción redox. ${\displaystyle pK_{a}^{\rm {ox}}<pK_{a}^{\rm {red}}}$ ${\displaystyle pK_{a}^{\rm {ox}}<pH<pK_{a}^{\rm {red}}}$

Se deben considerar dos casos dependiendo de si la reacción acoplada es lenta o rápida (lo que significa que la escala de tiempo de la reacción acoplada es mayor o menor que la escala de tiempo voltamperométrica ^[10] ). ${\displaystyle \tau =RT/F\nu }$

• Las reacciones químicas rápidas que están acopladas a la transferencia de electrones (como la protonación) solo afectan los valores aparentes de y , ^[7] pero los picos permanecen simétricos. La dependencia de de la concentración de ligando (por ejemplo, la dependencia de del pH representada en un diagrama de Pourbaix ) se puede interpretar para obtener las constantes de disociación (por ejemplo, las constantes de acidez ) a partir de las formas oxidadas o reducidas de las especies redox. ${\displaystyle E^{0}}$ ${\displaystyle k^{0}}$ ${\displaystyle E^{0}}$ ${\displaystyle E^{0}}$
• La asimetría puede ser resultado de reacciones químicas lentas que están acopladas a (y que regulan ) la transferencia de electrones. A partir de la voltamperometría de barrido rápido, se puede obtener información sobre las velocidades de las reacciones que están acopladas a la transferencia de electrones. El caso de reacciones electroquímicas de superficie reversibles seguidas de reacciones químicas irreversibles fue abordado por Laviron en las referencias ^{[6] , [11],} pero los datos se interpretan generalmente utilizando la solución numérica de las ecuaciones diferenciales apropiadas. ^[9] ${\displaystyle n=1}$ ${\displaystyle n=2}$

Experimentos con enzimas redox

En los estudios de enzimas , la corriente resulta de la oxidación o reducción catalítica del sustrato de la enzima .

La cobertura electroactiva de las grandes enzimas redox (como la lacasa , la hidrogenasa , etc.) suele ser demasiado baja para detectar cualquier señal en ausencia de sustrato, pero la señal electroquímica se amplifica mediante catálisis: de hecho, la corriente catalítica es proporcional a la tasa de recambio multiplicada por la cobertura electroactiva. Se puede examinar el efecto de variar el potencial del electrodo, el pH o la concentración de sustratos e inhibidores , etc. para conocer los distintos pasos del mecanismo catalítico. ^[8]

Interpretación del valor de la corriente catalítica

Para una enzima inmovilizada sobre un electrodo, el valor de la corriente a un cierto potencial es igual a , donde es el número de electrones intercambiados en la reacción catalítica, es la superficie del electrodo, es la cobertura electroactiva, y TOF es la frecuencia de recambio (o "número de recambio") , es decir, el número de moléculas de sustrato transformadas por segundo y por molécula de enzima adsorbida). Este último puede deducirse del valor absoluto de la corriente solo con la condición de que se conozca, lo que rara vez es el caso. Sin embargo, la información se obtiene analizando el cambio relativo de la corriente que resulta de cambiar las condiciones experimentales. ${\displaystyle \pm nFA\Gamma \times {\rm {TOF}}}$ ${\displaystyle n}$ ${\displaystyle A}$ ${\displaystyle \Gamma }$ ${\displaystyle A\Gamma }$

Los factores que pueden influir en el TOF son (i) el transporte de masa del sustrato hacia el electrodo donde está inmovilizada la enzima ( difusión y convección ), (ii) la tasa de transferencia de electrones entre el electrodo y la enzima (transferencia de electrones interfacial), y (iii) la actividad "intrínseca" de la enzima, todos los cuales pueden depender del potencial del electrodo.

La enzima suele estar inmovilizada en un electrodo de trabajo de disco giratorio (RDE) que gira rápidamente para evitar el agotamiento del sustrato cerca del electrodo. En ese caso, el transporte de masa del sustrato hacia el electrodo donde se adsorbe la enzima puede no ser influyente.

Respuesta voltamétrica en estado estacionario

En condiciones muy oxidantes o muy reductoras, la corriente catalítica en estado estacionario tiende a veces a un valor límite (una meseta) que (siempre que no haya una limitación de transporte de masa) se relaciona con la actividad de la enzima completamente oxidada o completamente reducida, respectivamente. Si la transferencia de electrones interfacial es lenta y si hay una distribución de tasas de transferencia de electrones (resultante de una distribución de orientaciones de las moléculas de enzimas en el electrodo), la corriente sigue aumentando linealmente con el potencial en lugar de alcanzar una meseta; en ese caso, la pendiente límite es proporcional a la tasa de recambio de la enzima completamente oxidada o completamente reducida. ^[8]

El cambio de la corriente en estado estacionario frente al potencial suele ser complejo (por ejemplo, no meramente sigmoideo). ^[12]

Salida del estado estacionario

Otro nivel de complejidad proviene de la existencia de reacciones lentas impulsadas por redox que pueden cambiar la actividad de la enzima y hacer que la respuesta se aleje del estado estable. ^[13] Aquí, lento significa que la escala de tiempo de la (in)activación es similar a la escala de tiempo voltamperométrica ^[10] . Si se utiliza un RDE , estas (in)activaciones lentas se detectan por una histéresis en el voltamograma catalítico que no se debe al transporte de masa. La histéresis puede desaparecer a velocidades de barrido muy rápidas (si la inactivación no tiene tiempo para continuar) o a velocidades de barrido muy lentas (si la reacción de (in)activación alcanza un estado estable). ^[14] ${\displaystyle \tau =RT/F\nu }$

Combinación de voltamperometría y espectroscopia de película de proteínas

La voltamperometría convencional ofrece una imagen limitada de la interfaz enzima-electrodo y de la estructura de las especies implicadas en la reacción. Complementar la electroquímica estándar con otros métodos puede proporcionar una imagen más completa de la catálisis. ^{[15] [16] [17]}

Referencias

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2. Jeuken, Lars JC (23 de septiembre de 2009). "Electrodos para enzimas de membrana integral". Natural Product Reports . 26 (10): 1234–40. doi :10.1039/b903252e. ISSN  1460-4752. PMID  19779638.
3. Bard, Allen J. (2001). Métodos electroquímicos: fundamentos y aplicaciones . Faulkner, Larry R., 1944- (2.ª ed.). Nueva York: Wiley. ISBN 9780471043720.OCLC 43859504  .
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5. Chen, Kaisheng; Hirst, Judy; Camba, Raul; Bonagura, Christopher A.; Stout, C. David; Burgess, Barbara. K.; Armstrong, Fraser A. (15 de junio de 2000). "Mecanismo definido atómicamente para la transferencia de protones a un centro redox enterrado en una proteína". Nature . 405 (6788): 814–817. Bibcode :2000Natur.405..814C. doi :10.1038/35015610. ISSN  1476-4687. PMID  10866206. S2CID  4303347.
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