La pinza de voltaje es un método experimental utilizado por los electrofisiólogos para medir las corrientes iónicas a través de las membranas de células excitables, como las neuronas , mientras se mantiene el voltaje de la membrana en un nivel establecido. [1] Una pinza de voltaje básica medirá iterativamente el potencial de membrana y luego cambiará el potencial de membrana (voltaje) a un valor deseado agregando la corriente necesaria. Esto "sujeta" la membrana celular a un voltaje constante deseado, permitiendo que la pinza de voltaje registre qué corrientes se entregan. Debido a que las corrientes aplicadas a la celda deben ser iguales (y de carga opuesta ) a la corriente que atraviesa la membrana celular al voltaje establecido, las corrientes registradas indican cómo reacciona la celda a los cambios en el potencial de membrana. [2] Las membranas celulares de las células excitables contienen muchos tipos diferentes de canales iónicos , algunos de los cuales están dependientes de voltaje . La abrazadera de voltaje permite manipular el voltaje de la membrana independientemente de las corrientes iónicas, lo que permite estudiar las relaciones corriente-voltaje de los canales de la membrana. [3]
El concepto de pinza de voltaje se atribuye a Kenneth Cole [4] y George Marmont [5] en la primavera de 1947. [6] Insertaron un electrodo interno en el axón gigante de un calamar y comenzaron a aplicar una corriente. Cole descubrió que era posible utilizar dos electrodos y un circuito de retroalimentación para mantener el potencial de membrana de la célula en un nivel establecido por el experimentador.
Cole desarrolló la técnica de fijación de voltaje antes de la era de los microelectrodos , por lo que sus dos electrodos consistían en finos cables trenzados alrededor de una varilla aislante . Debido a que este tipo de electrodo sólo podía insertarse en las células más grandes, los primeros experimentos electrofisiológicos se realizaron casi exclusivamente en axones de calamar .
Los calamares lanzan chorros de agua cuando necesitan moverse rápidamente, como cuando escapan de un depredador. Para que este escape sea lo más rápido posible, cuentan con un axón que puede alcanzar 1 mm de diámetro (las señales se propagan más rápidamente por los axones grandes). El axón gigante del calamar fue la primera preparación que pudo usarse para bloquear el voltaje de una corriente transmembrana, y fue la base de los experimentos pioneros de Hodgkin y Huxley sobre las propiedades del potencial de acción. [6]
Alan Hodgkin se dio cuenta de que, para comprender el flujo de iones a través de la membrana, era necesario eliminar las diferencias en el potencial de membrana. [7] Utilizando experimentos con la pinza de voltaje, Hodgkin y Andrew Huxley publicaron cinco artículos en el verano de 1952 describiendo cómo las corrientes iónicas dan lugar al potencial de acción . [8] El artículo final propuso el modelo de Hodgkin-Huxley que describe matemáticamente el potencial de acción. El uso de pinzas de tensión en sus experimentos para estudiar y modelar en detalle el potencial de acción ha sentado las bases de la electrofisiología ; por lo que compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1963 . [7]
La pinza de tensión es un generador de corriente. El voltaje transmembrana se registra a través de un "electrodo de voltaje", en relación con tierra , y un "electrodo de corriente" pasa corriente a la celda. El experimentador establece un "voltaje de mantenimiento" o "potencial de comando", y la pinza de voltaje utiliza retroalimentación negativa para mantener la celda en este voltaje. Los electrodos están conectados a un amplificador, que mide el potencial de membrana y envía la señal a un amplificador de retroalimentación . Este amplificador también recibe una entrada del generador de señales que determina el potencial de comando, resta el potencial de membrana del potencial de comando ( comando V - V m ), magnifica cualquier diferencia y envía una salida al electrodo de corriente. Siempre que la celda se desvía del voltaje de mantenimiento, el amplificador operacional genera una "señal de error", es decir, la diferencia entre el potencial de comando y el voltaje real de la celda. El circuito de retroalimentación pasa corriente a la celda para reducir la señal de error a cero. Así, el circuito de pinza produce una corriente igual y opuesta a la corriente iónica.
La técnica de fijación de voltaje de dos electrodos (TEVC) se utiliza para estudiar las propiedades de las proteínas de membrana, especialmente los canales iónicos. [9] Los investigadores utilizan este método más comúnmente para investigar las estructuras de membrana expresadas en los ovocitos de Xenopus . El gran tamaño de estos ovocitos permite un fácil manejo y manipulabilidad. [10]
El método TEVC utiliza dos pipetas de baja resistencia, una que detecta voltaje y la otra que inyecta corriente. Los microelectrodos se llenan con una solución conductora y se insertan en la célula para controlar artificialmente el potencial de membrana. La membrana actúa como dieléctrico y como resistencia , mientras que los fluidos a ambos lados de la membrana funcionan como condensadores . [10] Los microelectrodos comparan el potencial de la membrana con un voltaje de comando, brindando una reproducción precisa de las corrientes que fluyen a través de la membrana. Las lecturas actuales se pueden utilizar para analizar la respuesta eléctrica de la celda a diferentes aplicaciones.
Esta técnica se prefiere a la abrazadera de un solo microelectrodo u otras técnicas de abrazadera de voltaje cuando las condiciones requieren resolver grandes corrientes. La alta capacidad de paso de corriente de la pinza de dos electrodos permite fijar grandes corrientes que son imposibles de controlar con técnicas de parche de un solo electrodo . [11] El sistema de dos electrodos también es deseable por su rápido tiempo de ajuste de la abrazadera y su bajo ruido. Sin embargo, el uso de TEVC tiene un uso limitado con respecto al tamaño de la celda. Es eficaz en ovocitos de mayor diámetro, pero más difícil de utilizar con células pequeñas. Además, el método TEVC está limitado porque el transmisor de corriente debe estar contenido en la pipeta. No es posible manipular el líquido intracelular durante el pinzamiento, lo cual es posible utilizando técnicas de pinzamiento con parche. [2] Otra desventaja tiene que ver con los problemas de "abrazadera de espacio". La pinza de voltaje de Cole utilizó un cable largo que sujetaba el axón del calamar uniformemente en toda su longitud. Los microelectrodos TEVC pueden proporcionar solo una fuente puntual espacial de corriente que puede no afectar uniformemente a todas las partes de una celda de forma irregular.
La técnica de abrazadera de voltaje de celda dual es una variación especializada de la abrazadera de voltaje de dos electrodos y solo se utiliza en el estudio de canales de unión entre espacios . [12] Las uniones hendidas son poros que unen directamente dos células a través de las cuales los iones y las moléculas pequeñas fluyen libremente. Cuando dos células en las que se expresan proteínas de unión gap, típicamente conexinas o innexinas , ya sea de forma endógena o mediante inyección de ARNm , se formará un canal de unión entre las células. Dado que hay dos celdas en el sistema, se utilizan dos juegos de electrodos. En cada celda se insertan un electrodo de registro y un electrodo de inyección de corriente, y cada celda se sujeta individualmente (cada conjunto de electrodos se conecta a un aparato separado y la integración de los datos se realiza por computadora). Para registrar la conductancia de unión , la corriente se varía en la primera celda mientras que el electrodo de registro en la segunda celda registra cualquier cambio en V m solo para la segunda celda. (El proceso se puede revertir con el estímulo ocurriendo en la segunda celda y el registro en la primera celda). Dado que el electrodo en la celda registrada no induce ninguna variación en la corriente, cualquier cambio en el voltaje debe ser inducido por el cruce de corriente hacia la celda registrada, a través de los canales de unión gap, desde la celda en la que se varió la corriente. [12]
Esta categoría describe un conjunto de técnicas en las que se utiliza un electrodo para fijar el voltaje. La técnica de pinzamiento continuo de un solo electrodo (SEVC-c) se utiliza a menudo con el registro de pinzamiento de parche. La técnica de fijación de voltaje de electrodo único discontinuo (SEVC-d) se utiliza con registro intracelular penetrante. Este único electrodo realiza las funciones tanto de inyección de corriente como de registro de tensión.
La técnica "patch-clamp" permite el estudio de canales iónicos individuales. Utiliza un electrodo con una punta relativamente grande (> 1 micrómetro) que tiene una superficie lisa (en lugar de una punta afilada). Se trata de un "electrodo de parche" (a diferencia del "electrodo afilado" que se utiliza para empalar células). Este electrodo se presiona contra una membrana celular y se aplica succión para tirar de la membrana celular hacia el interior de la punta del electrodo. La succión hace que la celda forme un sello hermético con el electrodo (un "sello de gigaohmios", ya que la resistencia es superior a un gigaohmios ).
SEV-c tiene la ventaja de que puede grabar desde células pequeñas que serían imposibles de atravesar con dos electrodos. Sin embargo:
Una pinza de voltaje de un solo electrodo, discontinua o SEVC-d, tiene algunas ventajas sobre SEVC-c para el registro de células completas. En esto, se adopta un enfoque diferente para pasar corriente y registrar voltaje. Un amplificador SEVC-d funciona en régimen de " tiempo compartido ", por lo que el electrodo cambia de forma regular y frecuente entre corriente de paso y tensión de medición. En efecto, hay dos electrodos, pero cada uno está en funcionamiento sólo la mitad del tiempo que está encendido. La oscilación entre las dos funciones de un solo electrodo se denomina ciclo de trabajo. Durante cada ciclo, el amplificador mide el potencial de membrana y lo compara con el potencial de retención. Un amplificador operacional mide la diferencia y genera una señal de error. Esta corriente es una imagen especular de la corriente generada por la celda. Las salidas del amplificador cuentan con circuitos de muestreo y retención , por lo que cada voltaje muestreado brevemente se mantiene en la salida hasta la siguiente medición en el siguiente ciclo. Para ser específico, el amplificador mide el voltaje en los primeros microsegundos del ciclo, genera la señal de error y pasa el resto del ciclo pasando corriente para reducir ese error. Al comienzo del siguiente ciclo, se mide nuevamente el voltaje, se genera una nueva señal de error, pasa corriente, etc. El experimentador establece la duración del ciclo y es posible tomar muestras con períodos tan bajos como aproximadamente 15 microsegundos, correspondientes a 67 kHz. frecuencia de cambio. Las frecuencias de conmutación inferiores a aproximadamente 10 kHz no son suficientes cuando se trabaja con potenciales de acción de menos de 1 milisegundo de ancho. Tenga en cuenta que no todos los amplificadores de pinza de tensión discontinuos admiten frecuencias de conmutación superiores a 10 kHz. [10]
Para que esto funcione, la capacitancia de la celda debe ser mayor que la capacitancia del electrodo en al menos un orden de magnitud . La capacitancia ralentiza la cinética (los tiempos de subida y bajada) de las corrientes. Si la capacitancia del electrodo es mucho menor que la de la celda, entonces cuando la corriente pasa a través del electrodo, el voltaje del electrodo cambiará más rápido que el voltaje de la celda. Por lo tanto, cuando se inyecta corriente y luego se apaga (al final de un ciclo de trabajo), el voltaje del electrodo disminuirá más rápido que el voltaje de la celda. Tan pronto como el voltaje del electrodo es asíntoto al voltaje de la celda, se puede muestrear el voltaje (nuevamente) y aplicar la siguiente cantidad de carga. Por tanto, la frecuencia del ciclo de trabajo está limitada a la velocidad a la que el voltaje del electrodo aumenta y disminuye mientras pasa la corriente. Cuanto menor sea la capacitancia del electrodo, más rápido se podrá realizar el ciclo.
SEVC-d tiene una gran ventaja sobre SEVC-c al permitir al experimentador medir el potencial de membrana y, como evita el paso de corriente y la medición de voltaje al mismo tiempo, nunca hay un error de resistencia en serie. Las principales desventajas son que la resolución temporal es limitada y el amplificador es inestable. Si pasa demasiada corriente, de modo que se sobrepasa el voltaje objetivo, invierte la polaridad de la corriente en el siguiente ciclo de trabajo. Esto hace que no alcance el voltaje objetivo, por lo que el siguiente ciclo invierte nuevamente la polaridad de la corriente inyectada. Este error puede crecer con cada ciclo hasta que el amplificador oscile fuera de control (“timbre”); Esto suele provocar la destrucción de la célula que se está grabando. El investigador quiere un ciclo de trabajo corto para mejorar la resolución temporal; El amplificador tiene compensadores ajustables que harán que el voltaje del electrodo decaiga más rápido, pero si se configuran demasiado alto, el amplificador sonará, por lo que el investigador siempre está tratando de "sintonizar" el amplificador lo más cerca posible del borde de la oscilación incontrolada. en cuyo caso pequeños cambios en las condiciones de grabación pueden provocar timbres. Hay dos soluciones: “retroceder” la configuración del amplificador a un rango seguro o estar alerta a las señales de que el amplificador está a punto de sonar.
Desde el punto de vista de la teoría del control , el experimento de fijación de voltaje puede describirse en términos de la aplicación de una ley de control de retroalimentación de salida de alta ganancia [13] a la membrana neuronal. [14] Matemáticamente, el voltaje de la membrana se puede modelar mediante un modelo basado en conductancia con una entrada dada por la corriente aplicada y una salida dada por el voltaje de la membrana . El modelo original basado en la conductancia de Hodgkin y Huxley, que representa una membrana neuronal que contiene corrientes de iones de sodio y potasio , así como una corriente de fuga , viene dado por el sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias.
donde es la capacitancia de la membrana, y son conductancias máximas, y son potenciales de inversión, y son constantes de velocidad dependientes del voltaje del canal iónico, y las variables de estado , y son variables de activación del canal iónico .
Es posible demostrar rigurosamente que la ley de retroalimentación
impulsa el voltaje de la membrana arbitrariamente cerca del voltaje de referencia a medida que la ganancia aumenta a un valor arbitrariamente grande. [14] Este hecho, que de ninguna manera es una propiedad general de los sistemas dinámicos (una alta ganancia puede, en general, conducir a inestabilidad [15] ), es una consecuencia de la estructura y las propiedades del modelo basado en la conductancia. arriba. En particular, la dinámica de cada variable de activación , que es impulsada por , verifica la fuerte propiedad de estabilidad de la contracción exponencial. [14] [16]