En microbiología , unidad formadora de colonias ( UFC, ufc o UFC ) es una unidad que estima el número de células microbianas ( bacterias , hongos , virus , etc.) en una muestra que son viables , capaces de multiplicarse mediante fisión binaria en condiciones controladas. . Para contar las unidades formadoras de colonias es necesario cultivar los microbios y contar sólo las células viables, a diferencia del examen microscópico que cuenta todas las células, vivas o muertas. La apariencia visual de una colonia en un cultivo celular requiere un crecimiento significativo y, al contar las colonias , no se sabe si la colonia surgió de una célula o de un grupo de células. Expresar los resultados como unidades formadoras de colonias refleja esta incertidumbre.
Teoría
Se coloca una dilución hecha con bacterias y agua peptonada en una placa de agar ( recuento en placa de agar para muestras de alimentos o agar de soja tripticasa para muestras clínicas) y se extiende sobre la placa inclinándola siguiendo el patrón que se muestra.
El propósito del recuento en placa es estimar el número de células presentes en función de su capacidad para dar lugar a colonias en condiciones específicas de medio nutritivo, temperatura y tiempo. Teóricamente, una célula viable puede dar lugar a una colonia mediante replicación. Sin embargo, las células solitarias son una excepción en la naturaleza y lo más probable es que el progenitor de la colonia fuera una masa de células depositadas juntas. [1] [2] Además, muchas bacterias crecen en cadenas (por ejemplo, Streptococcus ) o grupos (por ejemplo, Staphylococcus ). La estimación del número de microbios mediante UFC, en la mayoría de los casos, subestimará el número de células vivas presentes en una muestra por estos motivos. Esto se debe a que el recuento de UFC supone que cada colonia está separada y fundada por una única célula microbiana viable. [3]
El recuento en placa es lineal para E. coli en el rango de 30 a 300 UFC en una placa de Petri de tamaño estándar . [4] Por lo tanto, para garantizar que una muestra produzca UFC en este rango es necesario diluir la muestra y sembrar en placas varias diluciones. Normalmente, se utilizan diluciones diez veces mayores y la serie de diluciones se siembra en réplicas de 2 o 3 en el rango de diluciones elegido. A menudo se siembran en placas 100 µL, pero también se utilizan cantidades mayores, de hasta 1 ml. Los volúmenes de recubrimiento más altos aumentan los tiempos de secado, pero a menudo no dan como resultado una mayor precisión, ya que pueden ser necesarios pasos de dilución adicionales. [5] Las UFC/placa se leen de una placa en el rango lineal y luego las UFC/g (o UFC/mL) del original se deducen matemáticamente, teniendo en cuenta la cantidad sembrada y su factor de dilución.
Una solución de bacterias en una concentración desconocida a menudo se diluye en serie para obtener al menos una placa con un número contable de bacterias. En esta figura, la placa "x10" es adecuada para contar.
Una ventaja de este método es que diferentes especies microbianas pueden dar lugar a colonias que son claramente diferentes entre sí, tanto microscópica como macroscópicamente . La morfología de la colonia puede ser de gran utilidad en la identificación del microorganismo presente. [6]
Una comprensión previa de la anatomía microscópica del organismo puede brindar una mejor comprensión de cómo se relacionan las UFC/mL observadas con la cantidad de células viables por mililitro. Alternativamente, en algunos casos es posible disminuir el número promedio de células por UFC agitando la muestra antes de realizar la dilución. Sin embargo, muchos microorganismos son delicados y sufrirían una disminución en la proporción de células viables si se colocaran en un vórtice. [7]
Las unidades formadoras de colonias se utilizan para cuantificar los resultados en muchos métodos de recuento y siembra microbiológica, entre ellos:
El método de vertido en placa en el que la muestra se suspende en una placa de Petri utilizando agar fundido enfriado a aproximadamente 40–45 °C (justo por encima del punto de solidificación para minimizar la muerte celular inducida por el calor). Una vez que el agar nutritivo se solidifica, se incuba la placa. [11]
El método de placa extendida en el que la muestra (en un volumen pequeño) se extiende sobre la superficie de una placa de agar nutritivo y se deja secar antes de la incubación para el recuento. [11]
El método de filtro de membrana en el que la muestra se filtra a través de un filtro de membrana y luego el filtro se coloca sobre la superficie de una placa de agar nutritivo (con las bacterias hacia arriba). Durante la incubación, los nutrientes se filtran a través del filtro para apoyar las células en crecimiento. Como el área de superficie de la mayoría de los filtros es menor que la de una placa de Petri estándar, el rango lineal del recuento de la placa será menor. [11]
Los métodos de Miles y Misra o método de placa de gota en el que se deja caer una alícuota muy pequeña (normalmente unos 10 microlitros) de muestra de cada dilución en serie sobre una placa de Petri. El plato de goteo debe leerse mientras las colonias son muy pequeñas para evitar la pérdida de UFC a medida que crecen juntas. [12]
Sin embargo, con las técnicas que requieren el uso de una placa de agar, no se puede utilizar ninguna solución fluida porque no se puede identificar la pureza de la muestra y no es posible contar las células una por una en el líquido. [13]
Herramientas para contar colonias.
La forma tradicional de enumerar las UFC con un "contador de clics" y un bolígrafo. Cuando las colonias son demasiado numerosas, es una práctica común contar las UFC sólo en una fracción del plato.
El recuento de colonias se realiza tradicionalmente de forma manual utilizando un bolígrafo y un contador de clics. Esta es generalmente una tarea sencilla, pero puede resultar muy laboriosa y consumir mucho tiempo cuando es necesario enumerar muchas placas. Alternativamente, se pueden utilizar soluciones semiautomáticas (software) y automáticas (hardware + software). [14] [15] [16]
Software para contar UFC
Las colonias se pueden enumerar a partir de fotografías de placas utilizando herramientas de software. Los experimentadores generalmente toman una fotografía de cada placa que necesitan contar y luego analizan todas las imágenes (esto se puede hacer con una simple cámara digital o incluso una cámara web). Dado que se necesitan menos de 10 segundos para tomar una sola fotografía, a diferencia de varios minutos para contar las UFC manualmente, este método generalmente ahorra mucho tiempo. Además, es más objetivo y permite extraer otras variables como el tamaño y color de las colonias. [dieciséis]
OpenCFU es un programa gratuito y de código abierto diseñado para optimizar la facilidad de uso, la velocidad y la solidez. Ofrece una amplia gama de filtros y controles, así como una interfaz de usuario moderna. OpenCFU está escrito en C++ y utiliza OpenCV para el análisis de imágenes. [17]
NICE es un programa escrito en MATLAB que proporciona una manera sencilla de contar colonias a partir de imágenes. [18]
ImageJ y CellProfiler : algunas macros y complementos de ImageJ [19] y algunas canalizaciones de CellProfiler [20] se pueden utilizar para contar colonias. Esto a menudo requiere que el usuario cambie el código para lograr un flujo de trabajo eficiente, pero puede resultar útil y flexible. Un problema principal es la ausencia de una GUI específica que puede hacer que la interacción con los algoritmos de procesamiento sea tediosa.
Además del software basado en computadoras de escritorio tradicionales, hay aplicaciones disponibles para dispositivos Android e iOS para el recuento de colonias automatizado y semiautomático. La cámara integrada se utiliza para tomar fotografías de la placa de agar y se utiliza un algoritmo interno o externo para procesar los datos de las imágenes y estimar el número de colonias. [21] [22] [23]
Sistemas automatizados
Muchos de los sistemas automatizados se utilizan para contrarrestar el error humano, ya que muchas de las técnicas de investigación realizadas por humanos que cuentan células individuales tienen una alta probabilidad de error. Debido al hecho de que los investigadores cuentan regularmente las células manualmente con la ayuda de una luz transmitida, esta técnica propensa a errores puede tener un efecto significativo en la concentración calculada en el medio líquido principal cuando las células están en cantidades bajas. [24]
Un contador de colonias automatizado que utiliza procesamiento de imágenes.
Algunos fabricantes de biotecnología también ofrecen sistemas completamente automatizados. [25] [26] Generalmente son costosos y no tan flexibles como el software independiente, ya que el hardware y el software están diseñados para funcionar juntos para una configuración específica. [18]
Alternativamente, algunos sistemas automáticos utilizan el paradigma de revestimiento en espiral . [27]
Algunos de los sistemas automatizados como los sistemas de MATLAB permiten contar las células sin tener que teñirlas. Esto permite reutilizar las colonias para otros experimentos sin el riesgo de matar los microorganismos con tinciones. Sin embargo, una desventaja de estos sistemas automatizados es que es extremadamente difícil diferenciar entre los microorganismos con polvo o rayones en placas de agar sangre porque tanto el polvo como los rayones pueden crear una combinación muy diversa de formas y apariencias. [28]
Unidades alternativas
En lugar de unidades formadoras de colonias, se pueden utilizar los parámetros Número más probable (MPN) y Unidades Fishman modificadas (MFU) [29] . El método del número más probable cuenta células viables y es útil cuando se enumeran concentraciones bajas de células o se enumeran microbios en productos donde las partículas hacen que el recuento en placa no sea práctico. [30] Las unidades Fishman modificadas tienen en cuenta bacterias que son viables, pero no cultivables.
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