La toxina del ántrax es una exotoxina de tres proteínas secretada por cepas virulentas de la bacteria Bacillus anthracis , el agente causante del ántrax . La toxina fue descubierta por primera vez por Harry Smith en 1954. [1] La toxina del ántrax se compone de una proteína de unión a células, conocida como antígeno protector (PA), y dos componentes enzimáticos, llamados factor de edema (EF) y factor letal (LF). Estos tres componentes proteicos actúan juntos para impartir sus efectos fisiológicos. Los complejos ensamblados que contienen los componentes de la toxina son endocitados. En el endosoma, los componentes enzimáticos de la toxina se translocan al citoplasma de una célula diana. Una vez en el citosol, los componentes enzimáticos de la toxina interrumpen varias funciones de las células inmunitarias, a saber, la señalización celular y la migración celular. La toxina puede incluso inducir la lisis celular, como se observa en las células macrófagas . La toxina del ántrax permite a las bacterias evadir el sistema inmunológico , proliferar y, en última instancia, matar al animal huésped. [2] Las investigaciones sobre la toxina del ántrax también proporcionan información sobre la generación de conjuntos macromoleculares , la translocación de proteínas , la formación de poros, la endocitosis y otros procesos bioquímicos .
El ántrax es una enfermedad causada por Bacillus anthracis , una bacteria formadora de esporas, Gram positiva y con forma de bastón (Fig. 1). La letalidad de la enfermedad es causada por los dos principales factores de virulencia de la bacteria: (i) la cápsula de ácido poliglutámico , que es antifagocítica , y (ii) la toxina proteica tripartita, llamada toxina del ántrax. La toxina del ántrax es una mezcla de tres componentes proteicos : (i) antígeno protector (PA), (ii) factor de edema (EF) y (iii) factor letal (LF).
La toxina del ántrax es una toxina AB . Cada proteína de la toxina del ántrax individual no es tóxica. No se observan síntomas tóxicos cuando estas proteínas se inyectan individualmente en animales de laboratorio. La coinyección de PA y EF causa edema , y la coinyección de PA y LF es letal. La primera combinación se denomina toxina del edema y la segunda se denomina toxina letal. Por lo tanto, la manifestación de los síntomas fisiológicos requiere PA, en ambos casos.
El requerimiento de PA observado en experimentos con modelos animales demuestra un paradigma común para las toxinas bacterianas, llamado paradigma A / B . El componente A es enzimáticamente activo, y el componente B es el componente de unión celular. La toxina del ántrax es de la forma A2B , donde las dos enzimas , EF y LF, son los componentes A y PA es el componente B. PA es necesario para que los componentes enzimáticos entren en la célula. Esto lo hace mediante la formación de poros que abarcan la membrana celular, lo que permite la entrada de la toxina, aunque el mecanismo no se entiende completamente. [3] Una vez en el citosol, pueden catalizar reacciones que alteran la fisiología celular normal.
Los componentes de la proteína de la toxina del ántrax deben ensamblarse en complejos de holotoxina para funcionar. Para que LF y EF funcionen dentro de una célula diana, deben localizarse en la célula y entrar en su citoplasma. A través de una serie de pasos, PA puede translocar EF y LF a la célula (Fig. 2). Este proceso comienza cuando la forma de 83 kDa de PA, llamada PA83, se une a un receptor de toxina del ántrax. Hay dos receptores homólogos conocidos, que se unen a PA83, llamados marcador de endotelio tumoral-8 ( TEM8 ) y proteína de morfogénesis capilar 2 ( CMG2 ). [4] Luego, un fragmento de 20 kDa (PA20) se escinde del extremo amino de PA83 por endoproteasas de membrana de la familia de las furinas. Cuando PA20 se disocia, la porción restante unida al receptor de PA, llamada PA63, puede ensamblarse en un oligómero en forma de anillo heptamérico [5] u octamérico [6] . Este oligómero en forma de anillo se conoce a menudo como la forma preporal (o precanal) de PA, ya que más adelante en la vía se convertirá en un poro (o canal) de translocasa. La superficie del oligómero preporal, que quedó expuesta tras la liberación de la fracción PA20, puede unirse a LF y EF. [7] Las formas heptaméricas y octaméricas del oligómero de PA pueden unirse a hasta tres o cuatro moléculas de EF y/o LF, respectivamente. [6] [8] La célula luego endocitosa estos complejos ensamblados y los lleva a un compartimento ácido en la célula. El bajo pH encontrado en el endosoma hace que el precanal PA63 se convierta en un canal selectivo de cationes. EF y LF son impulsados a través del canal por un gradiente de pH, lo que permite que los factores enzimáticos ingresen al citosol . [9]
Una vez en el citosol, el EF y el LF llevan a cabo sus respectivos procesos inductores de daño. [10]
Así, el efecto sinérgico de estas tres proteínas conduce a la muerte celular a través de una cascada de eventos que permiten que las proteínas ingresen a la célula e interrumpan la función celular.
El mecanismo de acción de la toxina del ántrax es el resultado de las estructuras moleculares de las tres proteínas de la toxina en combinación con biomoléculas de la célula huésped. Las interacciones moleculares son evidentes al realizar un análisis detallado de las estructuras de PA, EF, LF y los receptores celulares ( ANTXR1 y ANTXR2 ). Las estructuras de las moléculas de la toxina (Figs. 3-5), el receptor y los complejos de las moléculas proporcionaron información sobre las acciones sinérgicas de estas proteínas. Los análisis de los sitios de unión y los cambios conformacionales ampliaron los estudios estructurales, elucidando las funciones de cada dominio de PA, LF y EF, como se describe brevemente en la Tabla 1.
La estructura de PA fue la primera en determinarse (Fig. 3). [11] Esta estructura y la de su receptor celular arrojaron mucha luz sobre la especificidad del reconocimiento y la unión. [12] Esta especificidad de PA y el receptor CMG2 (similar a las integrinas de tipo I) se debe a interacciones a través de un sitio de adhesión dependiente de iones metálicos (MIDAS), un surco hidrofóbico y una proyección de horquilla β . Todos estos factores contribuyen a una interacción estrecha en la que se encuentra sepultada gran parte de la superficie proteica de CMG2 (y TEM8). [13]
Petosa et al. resolvieron la estructura de un heptámero de PA63 a 4,5 Å (0,45 nm). [11] La estructura que resolvieron fue la de un preporo no unido a la membrana, la conformación del heptámero antes de que el complejo extienda un barril β a través de la membrana plasmática para transportar el LF y el EF al citosol.
La heptamerización y la formación de poros se ven impedidas estéricamente por el fragmento PA20, pero cuando se retira de la parte superior del monómero, se forma rápidamente el preporo. La formación del heptámero no provoca cambios importantes en la conformación de cada monómero individual, pero al unirse, se entierran más de 15400 Ų (154 nm 2 ) de la superficie de la proteína. Esta superficie enterrada consiste principalmente en grupos laterales polares o cargados de los dominios 1 y 2. [11]
El PA también forma una estructura de precanal octamérica. [6] Se demostró que la forma octamérica es más termoestable que la forma heptamérica y, por lo tanto, el oligómero octamérico puede persistir en el plasma del huésped durante una infección por ántrax. [6]
Durante la oligomerización de PA63, las moléculas de EF y/o LF se unen rápida y simultáneamente al precanal de PA. Esta unión se produce porque después de eliminar el dominio PA20, se descubre una gran superficie hidrofóbica en el dominio 1 de PA63. El dominio 1 proporciona una gran superficie que interactúa con el extremo N-terminal de EF y LF, [14] que es casi completamente homólogo para los primeros ~36 residuos y similar en estructura terciaria para los primeros ~250 residuos. [15] Los estudios sobre la región de unión de LF y EF demostraron que una gran área de superficie contacta con el dominio 1 de dos moléculas adyacentes de PA63 cuando están en la conformación de heptámero. [16] Esta gran área de unión explica por qué los estudios anteriores solo podían unir hasta tres moléculas en un heptámero de PA63. La estructura de cocristal del octámero de PA en complejo con LF N-terminal reveló que la interacción de unión es, de hecho, dos sitios discontinuos. [14] Un sitio, denominado subsitio C-terminal, se asemeja a un "punto caliente" clásico con puentes salinos e interacciones electrostáticas predichas. El otro sitio, denominado subsitio de fijación alfa, es una hendidura profunda que une de manera no específica la hélice alfa N-terminal y la hebra beta corta de LF, guiando el extremo N-terminal del sustrato hacia el lumen del precanal PA. De esta manera, la fijación alfa ayuda en la translocación de proteínas, uniéndose de manera no específica y posteriormente desplegando la estructura secundaria a medida que se despliega del sustrato. [17] El sitio de unión LF/EF ahora se está utilizando para la administración de terapias a través de proteínas de fusión.
Tras la formación del preporo y la unión de LF y/o EF, el heptámero migra a una balsa lipídica donde es endocitado rápidamente. La endocitosis ocurre como resultado de una serie de eventos. Esto comienza cuando CMG2 o TEM8 se palmitoilan, lo que inhibe la asociación del receptor con las balsas lipídicas. Esto inhibe que el receptor sea endocitado antes de que PA83 se escinda y antes de que LF o EF puedan asociarse con el heptámero. La reasociación del receptor con los microdominios ricos en colesterol y glucoesfigolípidos ( balsas lipídicas ) ocurre cuando PA63 se une al receptor y se heptameriza. Una vez que el receptor y PA regresan a la balsa lipídica, la ligasa de ubiquitina E3 Cb1 ubiquitina la cola citoplasmática del receptor, lo que envía señales al receptor y a las proteínas de toxina asociadas para la endocitosis. La dinamina y el Eps15 son necesarios para que se produzca esta endocitosis, lo que indica que la toxina del ántrax entra en la célula a través de la vía dependiente de la clatrina . [18]
Como se ha comentado, cada molécula interactúa con varias otras para inducir la endocitosis de la toxina del ántrax. Una vez dentro, el complejo se transfiere a un compartimento ácido, donde el heptámero, todavía en la conformación preporosa que no atraviesa la membrana, se prepara para la translocación de EF y LF al citosol. [19]
A primera vista, la secuencia primaria de PA no parece la de una proteína que atraviesa la membrana. Un diagrama de hidrofobicidad carece de patrones que sean comunes a los posibles dominios que atraviesan la membrana. Las estructuras de otras proteínas de membrana multiméricas (como la toxina de la difteria ) proporcionan la respuesta a cómo PA logra atravesar la membrana. Se cree que PA actúa como estas proteínas de membrana multiméricas que forman barriles β hechos de tramos de aminoácidos tanto polares como no polares de cada monómero. [11]
La formación del poro en forma de barril β se facilita con una caída del pH. Para formar el barril cuando el pH baja, el dominio 2 de PA63 debe sufrir el mayor cambio de conformación. Al examinar la estructura del dominio 2 (Fig. 7), se puede ver que este dominio contiene un motivo de clave griega (la porción dorada en la Fig. 7). En la Fig. 8 se muestra un esquema general de un motivo de clave griega. Unido a la clave griega en el dominio 2 hay un gran bucle desordenado. La necesidad de este bucle en la formación de poros se demuestra mediante el uso de mutagénesis y proteólisis del bucle con quimotripsina. Las mediciones electrofisiológicas adicionales de las sustituciones de cisteína colocan los aminoácidos de este bucle dentro del lumen del poro insertado en la membrana. El bucle desordenado en el dominio 2 también tiene un patrón de aminoácidos hidrófobos e hidrófilos alternados, que es un patrón conservado en las porciones de las porinas que atraviesan la membrana. El único problema es que el bucle no es lo suficientemente grande como para abarcar una membrana en un barril β. Esta inserción en la membrana solo podría ocurrir con cambios conformacionales adicionales. Se produce un gran cambio conformacional donde se despliega el motivo de clave griega, formando una horquilla β que se proyecta hacia abajo en la membrana y forma un barril β con los otros 6 monómeros del complejo (figuras 9a y 9b). El poro final tiene un diámetro de 12 Å (1,2 nm), que se ajusta al valor teórico de este modelo. [11]
Este modelo requeriría grandes cambios conformacionales en el dominio 2 junto con la ruptura de muchos enlaces de hidrógeno a medida que el motivo de clave griega se despega del centro del dominio. Petosa et al. propusieron un modelo de cómo ocurre esto. [11] La inserción de los motivos de clave griega de PA en la membrana ocurre cuando se acidifica el heptámero. En bicapas artificiales, esto ocurre cuando el pH se reduce de 7,4 a 6,5, lo que sugiere que el desencadenante de la inserción implica una titulación de histidinas. Esto de hecho se ajusta a la secuencia de PA ya que el dominio 2 contiene una cantidad de histidinas (mostradas como asteriscos en la figura 9a). Se encuentran tres residuos de histidina en el bucle desordenado, uno de los cuales se encuentra con una histidina de clave griega dentro de un grupo de aminoácidos polares. Este grupo (que incluye las dos histidinas, tres argininas y un glutamato) está incrustado en la parte superior del motivo de clave griega, por lo que es fácil ver que la protonación de estas histidinas interrumpiría el grupo. Además, otra histidina se encuentra en la base del motivo de clave griega junto con una serie de residuos hidrofóbicos (en el segmento verde en las figuras 7 y 9a). A un pH de 7,4, este segmento está ordenado, pero cuando los cristales crecen a un pH de 6,0, se vuelve desordenado. Esta transición de orden a desorden es el paso inicial de la inserción de la membrana de PA.
El PA se endocita como un heptámero soluble unido a sus receptores, con LF o EF unidos al heptámero como carga. El primer paso después de la endocitosis es la acidificación de la vesícula endocítica. La acidificación desempeña dos papeles en la vida útil de la toxina. En primer lugar, ayuda a relajar el fuerte control del receptor CMG2 o TEM8 sobre el PA, facilitando la formación de poros (los diferentes receptores permiten la inserción a un pH ligeramente diferente). [13] En segundo lugar, la caída del pH hace que un bucle desordenado y un motivo de clave griega en el dominio 2 del PA se plieguen fuera del preporo del heptámero y se inserten a través de la pared de la vesícula ácida, lo que conduce a la formación de poros (Figuras 7-9).
Santelli et al. explicaron más sobre el proceso después de determinar la estructura cristalina del complejo PA/CMG2. [13] La estructura de este complejo muestra la unión de CMG2 por parte de los dominios 2 y 4 de PA. Esta interacción demuestra una menor libertad para desplegar la clave griega. Un análisis posterior muestra que siete de las nueve histidinas en PA están en la interfaz del dominio 2/dominio 4. La protonación de estas histidinas hace que los dominios se separen lo suficiente para permitir que la clave griega se deslice hacia afuera y ayude a formar la horquilla β involucrada en la inserción. Además, cuando PA se une a CMG2, la inserción ya no ocurre a un pH de 6,5, como ocurre cuando se inserta en una membrana artificial. En cambio, requiere un pH de 5,0 para la inserción en células naturales. Se explicó que esta diferencia era el resultado del bolsillo junto al motivo MIDAS en CMG2. Este bolsillo contiene una histidina enterrada en el fondo donde se une el dominio 2. Esta histidina se protona a un pH más bajo y agrega mayor estabilidad a PA. Esta estabilidad adicional evita que la clave griega pueda moverse hasta que se alcancen condiciones más ácidas. Todas estas histidinas trabajan en conjunto para evitar que el heptámero se inserte prematuramente antes de que se produzca la endocitosis.
Santelli y sus colegas (Fig. 10) también construyeron una estructura hipotética de la estructura PA/CMG2 insertada en la membrana. Este modelo muestra que el barril β tiene una longitud de aproximadamente 70 Å (7 nm), de los cuales 30 Å (3 nm) abarcan la membrana y el espacio de 40 Å (4 nm) en realidad está lleno con el resto de la porción extracelular del receptor CMG2 (~100 residuos). CMG2 proporciona soporte adicional al poro.
Varios estudios recientes demuestran cómo el poro PA63 permite que el EF y el LF entren en el citoplasma cuando su luz es tan pequeña. La luz del poro PA63 tiene solo 15 Å (1,5 nm) de ancho, que es mucho más pequeño que el diámetro del LF o el EF. La translocación se produce a través de una serie de eventos que comienzan en el endosoma a medida que se acidifica. LF y EF son sensibles al pH y, a medida que baja el pH, sus estructuras pierden estabilidad. Por debajo de un pH de 6,0 (el pH en un endosoma), tanto LF como EF se convierten en glóbulos fundidos desordenados . Cuando una molécula está en esta conformación, el extremo N se libera y se atrae hacia el poro por el gradiente de protones y el potencial transmembrana positivo. Un anillo de siete fenilalaninas en el lado de la boca del endosoma del poro (pinza de fenilalanina) ayuda al despliegue de LF o EF al interactuar con los residuos hidrófobos que se encuentran en LF o EF. El gradiente de protones comienza entonces a hacer pasar la proteína a través del poro. El mecanismo de paso es impulsado por el gradiente, pero requiere la pinza de fenilalanina para un movimiento de trinquete. Los primeros 250 residuos de EF y LF tienen una secuencia alternada irregular de residuos básicos, ácidos e hidrófobos. La interacción entre la pinza de fenilalanina y el estado de protonación causa un efecto de trinquete que impulsa la proteína hasta que una cantidad suficiente ha cruzado al citoplasma para arrastrar al resto a través del poro mientras el extremo N se repliega. [20]