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La toxina A de Clostridioides difficile ( TcdA ) es una toxina producida por la bacteria Clostridioides difficile , anteriormente conocida como Clostridium difficile . [1] Es similar a la toxina B de Clostridium difficile . Las toxinas son los principales factores de virulencia producidos por la bacteria grampositiva , anaeróbica, [2] Clostridioides difficile . Las toxinas funcionan dañando la mucosa intestinal y causan los síntomas de la infección por C. difficile , incluida la colitis pseudomembranosa .
La TcdA es una de las toxinas bacterianas más grandes conocidas. Con una masa molecular de 308 kDa, se la suele describir como una potente enterotoxina [3] , pero también tiene cierta actividad como citotoxina [4] . La toxina actúa modificando las proteínas GTPasa de la célula huésped mediante glucosilación, lo que provoca cambios en las actividades celulares. Los factores de riesgo de la infección por C. difficile incluyen el tratamiento con antibióticos, que puede alterar la microbiota intestinal normal y provocar la colonización de la bacteria C. difficile [5] .
El gen contiene un marco de lectura abierto (ORF) de 8133 nucleótidos , que codifica 2710 aminoácidos . TcdA y TcdB comparten un 63% de homología en sus secuencias de aminoácidos. [6] Estos genes se expresan durante la fase logarítmica tardía y la fase estacionaria en respuesta a factores ambientales. El estrés ambiental, como los antibióticos y la represión de catabolitos, puede influir en la expresión de toxinas. [7]
Los genes tcdA y tcdB están situados en el cromosoma Clostridioides difficile en un locus de patogenicidad de 19,6 kb (PaLoc) que se encuentra solo en cepas toxigénicas de C. difficile . Las cepas no toxigénicas contienen un fragmento de 127 pares de bases que reemplaza al PaLoc. [8] Este locus también contiene otros tres genes accesorios tcdC , tcdR y tcdE . [9] La expresión de TcdC es alta durante la fase exponencial temprana y disminuye a medida que el crecimiento pasa a la fase estacionaria , en consonancia con los aumentos en la expresión de tcdA y tcdB . En consecuencia, los patrones de expresión han indicado que tcdC es un posible regulador negativo de la producción de toxinas. tcdR puede servir como un regulador positivo de la producción de toxinas. [7] Se ha especulado que tcdE facilita la liberación de TcdA y TcdB a través de la actividad lítica en la membrana celular bacteriana. Debido a su homología con otras proteínas de función similar, así como a la ubicación del gen entre tcdA y tcdB , se predice que tcdE funcionará como la proteína lítica que facilita la liberación ya que TcdA y TcdB carecen de un péptido señal para la secreción . [8]
La proteína contiene tres dominios. El dominio amino N-terminal contiene el sitio activo , responsable de la actividad glucosilante de la toxina. Tanto TcdA como TcdB utilizan esta región N-terminal altamente conservada (74% de homología entre ambas toxinas) para alterar sustratos idénticos . [7]
El dominio C-terminal del carboxilo contiene unidades repetitivas que son responsables de la unión del receptor en las superficies de las células diana. Estas unidades repetitivas homólogas cortas se han denominado oligopéptidos repetitivos combinados (CROP). [7] [10] Un estudio reciente demuestra que los CROP determinan la potencia de TcdA a través de interacciones con estructuras en la superficie celular. [11] Estas regiones CROP varían de 21 a 50 residuos y desempeñan un papel en la unión del receptor. [7] Esta región repetitiva C-terminal se designa como la región inmunodominante ya que la unión del ligando puede ser bloqueada por anticuerpos monoclonales específicos de esta región. [12] [13] Esta región contiene la porción más hidrófila de la molécula. [10]
Se cree que un dominio hidrofóbico ubicado centralmente que contiene un grupo de 172 aminoácidos hidrofóbicos altamente conservados es importante para la translocación de la porción enzimática de la proteína. [5] [6]
El TcdA debe ser internalizado en la célula huésped a través de endocitosis para poder acceder al citosol . La unión al receptor es el primer paso necesario para la entrada en la célula a través de endocitosis en un endosoma ácido . [6] El pH bajo en el endosoma induce cambios estructurales como la exposición de los dominios hidrofóbicos que son cruciales para la función del TcdA. [7] [14]
El dominio N-terminal de TcdA funciona para catalizar una reacción de glucotransferasa, que transfiere una molécula de glucosa desde UDP-Glucosa y la une covalentemente a aminoácidos conservados en moléculas diana. [6] Por lo tanto, TcdA cataliza la glucosilación y la posterior inactivación irreversible de moléculas diana en la familia Ras de pequeñas GTPasas. [9] Estas moléculas diana incluyen RhoA , Rac y Cdc42 , que son proteínas reguladoras del citoesqueleto de actina eucariota y moduladores de muchas vías de señalización celular diversas. [7]
La TcdA se dirige principalmente a Rho , Rac y Cdc42 . Estas moléculas son importantes reguladores de la señalización celular. Las GTPasas pequeñas como Rho, Rac y Cdc42 regulan su actividad alternando entre un estado activo unido a GTP y un estado inactivo unido a GDP . [7] Los factores de intercambio de guanina (GEF) regulan el intercambio de GTP y GDP . [15]
TcdA glucosila RhoA transfiriendo una molécula de glucosa desde UDP-glucosa , un azúcar nucleótido, a Thr-37 de la GTPasa RhoA. En Rac y Cdc42 , la porción de azúcar se transfiere a Thr-35. La glucosilación impide la unión adecuada de GTP y bloquea la activación. [7] TcdA actúa preferentemente sobre la forma unida a GDP de las proteínas GTPasa, ya que esta configuración expone el residuo de treonina que es glucosilado por la toxina. [5]
RhoA regula el citoesqueleto de actina y forma fibras de estrés y adhesiones focales . [16] Cuando RhoA se inactiva a través de TcdA, su interacción con los efectores posteriores se inhibe. Esto conduce a cambios en el citoesqueleto de actina que aumentan la permeabilidad del epitelio intestinal . Rac y Cdc42 están involucrados en la formación del filopodio , crucial para el movimiento y la migración celular. En general, Rho , Rac y Cdc42 regulan procesos en las células que dependen de la polimerización de actina. Muchos de los efectos fisiológicos que experimentan las células después de la exposición a TcdA pueden estar relacionados con la desregulación de la polimerización de actina y las vías celulares controladas por los objetivos de TcdA. [7]
La exposición a TcdA conduce a cambios inmediatos en la morfología celular, incluyendo la pérdida de integridad estructural debido a una disminución en la actina filamentosa ( F-actina ), y un aumento en la actina globular . [17] La desorganización de los filamentos de actina y el citoesqueleto conduce a una mayor permeabilidad de las uniones estrechas , lo que resulta en un daño grave de las células epiteliales y secreción de líquido. [18] [19] La acumulación y secreción de líquido son secundarias al daño de la mucosa que ocurre después de la exposición a TcdA. Los cambios distintivos en el sistema de microfilamentos conducen al redondeo celular y la muerte celular. [17] Estos cambios son el resultado de la inactivación de las proteínas Rho , que desempeñan un papel importante en la regulación de las uniones estrechas . [7] [20]
La apoptosis es el mecanismo más probable que explica la muerte de las células expuestas a TcdA. La inactivación de Rho puede activar la caspasa-3 y la caspasa-9 , dos componentes clave de la vía apoptótica. Se ha vinculado a TcdA con la alteración de la membrana mitocondrial y la liberación de citocromo C a través de la activación de la caspasa y la inactivación de Rho , lo que sugiere además que TcdA es capaz de inducir la apoptosis. [21] [22]
Los modelos animales han demostrado que la TcdA incluye diarrea, infiltración de neutrófilos , inflamación de la mucosa intestinal y necrosis de las células epiteliales . Esta toxina se considera la principal causa de CDAD. [18] La TcdA daña las puntas de las vellosidades intestinales, lo que altera la membrana del borde en cepillo , lo que provoca erosión celular y fuga de líquido del área dañada. Este daño y la respuesta de líquido asociada causan la diarrea asociada con la infección por Clostridioides difficile . [17]
El TcdA puede inducir los cambios fisiológicos que ocurren en la colitis pseudomembranosa relacionada con C. difficile (PMC), una ulceración grave del colon. El daño de la toxina a la mucosa colónica promueve acumulaciones de fibrina , mucina y células muertas para formar una capa de desechos en el colon (pseudomembrana), lo que causa una respuesta inflamatoria . [5] El daño de TcdA causa un aumento de la permeabilidad epitelial, la producción de citocinas y quimiocinas , la infiltración de neutrófilos, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la activación de los mastocitos y el daño directo a la mucosa intestinal. [23] Todo puede atribuirse a la inactivación inducida por TcdA de las proteínas Rho GTPasa . [20] La pérdida de uniones estrechas puede proporcionar la entrada de neutrófilos a los intestinos, lo que lleva a la acumulación de neutrófilos; un sello distintivo de la PMC. La producción de citocinas inducida por TcdA de IL-8 y otros mediadores inflamatorios contribuye a las etapas de inflamación observadas en la PMC. La infiltración por neutrófilos, macrófagos y mastocitos en respuesta al daño causado por TcdA aumenta la respuesta inflamatoria a través de la producción y liberación de otros mediadores como el factor de necrosis tumoral alfa , IL-1 , IL-6 y otras monocinas . Estos mediadores causan daño adicional a la mucosa intestinal y aumentan aún más la respuesta inflamatoria, lo que influye en la persistencia de las células madre pluripotentes intestinales. [24] Si se produce un daño extenso a la pared intestinal, las bacterias pueden ingresar al torrente sanguíneo y causar un choque séptico y la muerte. [5]
TcdA y TcdB están presentes en líquidos sobrenadantes de cultivos de C. difficile y pueden purificarse a partir de filtrados. Ambas toxinas se detectan consistentemente en muestras fecales de humanos y animales [25] y ahora se utilizan como marcadores para diagnosticar la infección por C. difficile . [7] Se encontró que más del 90% de los pacientes infectados con C. difficile tenían actividad citotóxica en sus heces. La glucosilación de las GTPasas Rho inactiva las proteínas GTPasa, lo que lleva al colapso del citoesqueleto, lo que resulta en el redondeo celular. Se ha desarrollado un ensayo de cultivo de tejidos para detectar toxinas de C. difficile en muestras de heces. [17] Se ha desarrollado un ensayo de redondeo celular (ensayo de citotoxicidad) para diagnosticar la infección por C. difficile . [11] Se han utilizado ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para detectar TcdA y TcdB con anticuerpos específicos . Cuando se utiliza con un ELISA, el ensayo de citotoxicidad es el "estándar de oro" cuando se utiliza en células Vero para el diagnóstico de C. difficile . [11]
Desde la década de 1980 y principios de la de 1990, se ha debatido mucho sobre el papel de TcdA y TcdB en la infección por C. difficile . Informes anteriores con toxinas purificadas indicaron que TcdA por sí sola era suficiente para causar síntomas de infección y TcdB no podía hacerlo a menos que se combinara con TcdA. [7] Un experimento más reciente indicó que TcdB era, de hecho, esencial para la virulencia . [26] Investigaciones anteriores establecieron TcdA estrictamente como una enterotoxina y TcdB como una citotoxina , pero más tarde se descubrió que ambas toxinas tenían el mismo mecanismo de acción. [6] Para investigar completamente el papel de ambas toxinas en la patogénesis de la infección por C. difficile , se desarrolló un sistema de eliminación de genes en un modelo de infección de hámster. Al eliminar permanentemente tcdA , tcdB o ambos (doble eliminación), se demostró que C. difficile que produce una o ambas toxinas era capaz de actividad citotóxica, y esta actividad se tradujo directamente en virulencia in vivo . También se encontró que una doble eliminación de tcdAtcdB atenuó completamente la virulencia . En general, esta investigación ha demostrado la importancia tanto de TcdA como de TcdB en la infección por C. difficile , mostrando que cualquiera de las toxinas es capaz de citotoxicidad. [9]