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La tinción de Romanowsky es una técnica de tinción prototípica que fue precursora de varias tinciones distintas pero similares ampliamente utilizadas en hematología (el estudio de la sangre) y citopatología (el estudio de las células enfermas). Las tinciones de tipo Romanowsky se utilizan para diferenciar células para examen microscópico en muestras patológicas , especialmente extensiones de sangre y médula ósea , [1] y para detectar parásitos como la malaria en la sangre. [2] [3] [4] [5]
La técnica de tinción lleva el nombre del médico ruso Dmitri Leonidovich Romanowsky (1861-1921), quien fue uno de los primeros en reconocer su potencial para su uso como tinción de sangre. [6]
Las tinciones que están relacionadas o derivadas de las tinciones de tipo Romanowsky incluyen las tinciones de Giemsa , Jenner , Wright , Field , May-Grünwald , Pappenheim y Leishman . Se diferencian en protocolos y aditivos y en la práctica sus nombres a menudo se confunden entre sí.
El valor de la tinción de Romanowsky radica en su capacidad para producir una amplia gama de tonos, lo que permite diferenciar fácilmente los componentes celulares. Este fenómeno se conoce como efecto Romanowsky , o más generalmente como metacromasia . [7]
La parte de eosina de la tinción es responsable del tono rosa anaranjado de los eritrocitos y los gránulos dentro del citoplasma de los leucocitos eosinófilos .
En 1891 Romanowsky [8] [9] [10] desarrolló una tinción utilizando una mezcla de eosina (típicamente eosina Y ) y soluciones envejecidas de azul de metileno que formaban tonos no atribuibles únicamente a los componentes de la tinción: tonos distintivos de púrpura en la cromatina de la núcleo celular y dentro de los gránulos en el citoplasma de algunos leucocitos . Esto se conoció como el efecto Romanowsky. [11] [12] [6] [13] [4] La eosina y el azul de metileno puro solos (o en combinación) no producen el efecto Romanowsky, [13] [4] y ahora se consideran las tinciones activas que producen el efecto. ser azul B y eosina. [14] [3] [13]
Los tintes tipo Romanowsky se pueden hacer a partir de una combinación de tintes puros o de azul de metileno que ha sido sujeto a desmetilación oxidativa , lo que resulta en la descomposición del azul de metileno en muchos otros tintes, algunos de los cuales son necesarios para producir el efecto Romanowsky. . [15] [4] El azul de metileno que ha sufrido este proceso oxidativo se conoce como "azul de metileno policromado". [15] [4] El azul de metileno policromado puede contener hasta 11 colorantes, incluidos azul de metileno , azul A , azul B, azul C, tionina , violeta de metileno de Bernthesen, metil tionolina y tionolina. [4] La composición exacta del azul de metileno policromado depende del método utilizado, e incluso los lotes de tinte del mismo fabricante pueden variar en composición. [15]
El método común de oxidación rápida utiliza aumentar el pH de la solución con carbonato de potasio y hervirla, lo que introduce oxígeno atmosférico . [16] También se han empleado otros métodos, como la oxidación en medio ácido con anión dicromato .
Aunque se ha demostrado que el azul B y la eosina son los componentes necesarios para producir el efecto Romanowsky, [14] [3] [13] estos tintes en sus formas puras no siempre se han utilizado en la formulación de las soluciones de tinción. [4] Las fuentes originales de azul B (uno de los productos de oxidación del azul de metileno) procedían de soluciones policromadas de azul de metileno, que se trataban con agentes oxidantes o se dejaban envejecer naturalmente en el caso de Romanowsky. [3] [13] Ernst Malachowsky en 1891 fue el primero en policromar deliberadamente azul de metileno para usarlo en una tinción tipo Romanowsky. [15] [17]
La tinción de Wright se puede utilizar sola o en combinación con la tinción de Giemsa, conocida como tinción de Wright-Giemsa. [1] La tinción de Wright lleva el nombre de James Homer Wright , quien en 1902 [18] publicó un método que utiliza calor para producir azul de metileno policromado, que se combina con eosina Y. [19] [20] [21] [1] La tinción de metileno policromada El azul se combina con eosina y se deja precipitar, formando un eosinato que se redisuelve en metanol . [4] La adición de Giemsa a la tinción de Wright aumenta el brillo del color "púrpura rojizo" de los gránulos citoplasmáticos. [1] [21] Las tinciones de Wright y Wright-Giemsa son dos de las tinciones de tipo Romanowsky de uso común en los Estados Unidos y se utilizan principalmente para teñir extensiones de sangre y médula ósea. [21] [1]
La tinción de Jenner se utiliza en microscopía para teñir frotis de sangre . La tinción es azul oscuro y da como resultado un núcleo claramente teñido y muy observable.
La tinción de Giemsa se compone de "Azure II" y eosina Y con metanol y glicerol como disolvente. [15] Se cree que "Azure II" es una mezcla de azul B (que Giemsa llamó "azul I") y azul de metileno, aunque la composición exacta de "azul I" se considera un secreto comercial. [4] [15] Se han publicado formulaciones comparables que utilizan colorantes conocidos y están disponibles comercialmente. La tinción de Giemsa se considera la tinción estándar para la detección e identificación del parásito de la malaria. [5]
El May-Grünwald-Giemsa se utiliza para la tinción de portaobjetos obtenidos mediante aspiración con aguja fina en un laboratorio de histopatología para el diagnóstico de células tumorales.
Este método es una combinación de tinción de May-Grünwald y Giemsa.
En 1901, William Leishman [22] desarrolló una tinción similar a la de Louis Jenner pero con la sustitución del azul de metileno puro por azul de metileno policromado. [19] [15] [4] La tinción de Leishman se prepara a partir del eosinato de azul de metileno policromado y eosina Y utilizando metanol como disolvente. [4]
La tinción de campo se utiliza para teñir extensiones de sangre gruesas con el fin de descubrir parásitos de la malaria .
Las tinciones de tipo Romanowsky se utilizan ampliamente en el examen de sangre, en forma de frotis sanguíneos y en el examen microscópico de biopsias de médula ósea y frotis de aspirado. [1] [23] El examen tanto de la sangre como de la médula ósea puede ser importante en el diagnóstico de una variedad de enfermedades de la sangre. [1] [23] En los Estados Unidos, las variantes de Wright y Wright-Giemsa de las tinciones tipo Romanowsky se utilizan ampliamente, [1] mientras que en Europa se emplea comúnmente la tinción de Giemsa. [1]
De las tinciones tipo Romanowsky, la tinción de Giemsa tiene especial importancia en la detección e identificación de parásitos de la malaria en muestras de sangre . [5] [15] Las pruebas de detección del antígeno de la malaria son una alternativa a la tinción y el examen microscópico de frotis de sangre para la detección de la malaria. [5]
Las tinciones de tipo Romanowsky también se utilizan para teñir muestras citopatológicas , como las producidas a partir de aspirados con aguja fina y líquido cefalorraquídeo de punciones lumbares . [24]
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Aunque existe debate sobre quién merece el crédito por este método de tinción general, el uso popular lo ha atribuido a Dmitri Leonidovich Romanowsky . [14] [17] [19]
En la década de 1870, Paul Ehrlich utilizó una mezcla de tintes ácidos y básicos, incluida la fucsina ácida (tinte ácido) y el azul de metileno (tinte básico) para examinar extensiones de sangre. [25] [26] [27] [28] [17] En 1888, Cheslav Ivanovich Chenzinsky utilizó azul de metileno, pero sustituyó la fucsina ácida utilizada por Ehrlich por eosina. [14] [27] [28] La combinación de tinciones de Chenzinsky pudo teñir el parásito de la malaria (un miembro del género Plasmodium ). [28] [19] Ni las tinciones de Ehrlich ni las de Chenzinsky produjeron el efecto Romanowsky ya que el azul de metileno que utilizaron no estaba policromado. [17]
Dmitri Romanowsky publicó en 1890 los resultados preliminares de su tinción de sangre (una combinación de azul de metileno envejecido y eosina), incluidos los resultados cuando se aplicó a sangre infectada con malaria. [6] Este uso de azul de metileno policromado diferenciaba la tinción de Romanowsky (y las formulaciones posteriores) de las de Ehrlich y Chenzinsky, que carecían del tono púrpura asociado con el efecto Romanowsky. [17] La publicación de Romanowsky de 1890 no incluía una descripción de cómo modificó su solución de azul de metileno, [6] [17] pero en su tesis doctoral de 1891 describió mejor el azul de metileno utilizado después de que comenzó a formarse moho en la superficie. [6] [17] Aparte del uso de una solución de azul de metileno envejecida, la tinción de Romanowsky se basó en la técnica de tinción de Chenzinsky. [17] El uso de Romanowsky de su método para estudiar el parásito de la malaria se ha atribuido al continuo interés en su método de tinción. [26]
A Ernst Malachowsky se le atribuye haber observado de forma independiente la misma combinación de manchas que Dmitri Romanowsky en 1891, [6] [13] aunque también se le atribuye ser el primero en hacerlo. [17] [19] Malachowsky fue el primero en utilizar una solución de azul de metileno deliberadamente policromada, [15] lo que Malachowsky logró mediante la adición de bórax a la mezcla de tinción. [17] Se informa que Malachowsky demostró la mancha el 15 de junio de 1890, y ese mismo año publicó un artículo "describiendo su demostración pública". [19] Tanto el método Romanowsky como el Malachowsky lograron teñir el núcleo y el citoplasma del parásito de la malaria , cuando hasta ese momento las tinciones utilizadas sólo habían coloreado el citoplasma. [19]
En 1899, Louis Leopold Jenner desarrolló una versión más estable de la tinción de azul de metileno y eosina recogiendo el precipitado que se forma en mezclas a base de agua y redisolviéndolo en metanol . [28] [15] [4] Las tinciones de tipo Romanowsky preparadas a partir de los precipitados recolectados a veces se conocen como eosinatos . [4] Además de aumentar la estabilidad de la tinción, el uso de metanol en la tinción de Jenner tuvo el efecto de fijar las muestras de sangre, [4] aunque la versión de Jenner de la tinción no produce el efecto Romanowsky. [28] [19] [15]
Richard May y Ludwig Grünwald publicaron en 1892 una versión de la tinción (ahora conocida como tinción de May-Grünwald ) que es similar a la versión propuesta por Jenner en 1899 y que tampoco produce el efecto Romanowsky. [28] [19] [15]
En 1901, tanto Karl Reuter como William Leishman [22] desarrollaron tintes que combinaban el uso de alcohol como disolvente por parte de Louis Jenner y el uso de azul de metileno policromado por parte de Malachowsky. [19] [15] [4] La tinción de Reuter se diferenciaba de la de Jenner en el uso de alcohol etílico en lugar de metanol, y la de Leishman se diferenciaba de la de Jenner en el uso de eosina B en lugar de eosina Y. [19] [4]
James Homer Wright en 1902 publicó [18] un método que utilizaba calor para policromar el azul de metileno, que combinó con eosina Y. Esta técnica se conoce como tinción de Wright . [19] [20]
El nombre de Gustav Giemsa también se ha asociado con la mancha, ya que se le atribuye la publicación de una formulación y un protocolo útiles en 1902. [13] [6] [26] Giemsa intentó utilizar combinaciones de tintes puros en lugar de soluciones policromadas de azul de metileno, que son altamente variable en composición. [20] [19] [15] Giemsa vendió los derechos para producir su tinte, pero nunca publicó detalles completos sobre cómo lo produjo, [19] aunque se cree que usó una combinación de azul B y azul de metileno. [15] Giemsa publicó una serie de modificaciones de sus tintes entre 1902 y 1934. En 1904 [29] sugirió añadir glicerina a su tinte, junto con metanol, para aumentar su estabilidad. [23] [19]
Los tintes en polvo de Giemsa producidos en Alemania se utilizaron ampliamente en los Estados Unidos hasta la interrupción del suministro durante la Primera Guerra Mundial , lo que provocó una mayor utilización del método de James Homer Wright para policromar el azul de metileno. [19] [1]