Un sitio de entrada interno al ribosoma , abreviado como IRES , es un elemento del ARN que permite la iniciación de la traducción de manera independiente de la tapa, como parte del proceso más amplio de síntesis de proteínas . La iniciación de la traducción eucariota casi siempre ocurre en la tapa 5' de las moléculas de ARNm y depende de ella, donde se forma el complejo de iniciación de la traducción y los ribosomas se acoplan al ARNm. Sin embargo, los elementos IRES permiten que los ribosomas se acoplen al ARNm y comiencen la traducción independientemente de la tapa 5'.
Las secuencias IRES se descubrieron por primera vez en 1988 en los genomas de ARN del virus de la polio (PV) y del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) en los laboratorios de Nahum Sonenberg [ 1] y Eckard Wimmer [2] respectivamente. Se describen como regiones distintas de moléculas de ARN que pueden reclutar el ribosoma eucariota al ARNm. Este proceso también se conoce como traducción independiente de la caperuza. Se ha demostrado que los elementos IRES tienen una estructura secundaria o incluso terciaria distintiva, pero hasta la fecha no se han informado características estructurales similares a niveles de estructura primaria o secundaria que sean comunes a todos los segmentos IRES.
El uso de secuencias IRES en biología molecular pronto se volvió común como una herramienta para expresar múltiples genes a partir de una sola unidad transcripcional en un vector genético . En dichos vectores, la traducción del primer cistrón se inicia en el extremo 5' y la traducción de cualquier cistrón posterior se habilita mediante un elemento IRES adjunto en su extremo 5'. [3]
Los elementos IRES se encuentran más comúnmente en la región no traducida 5' , pero también pueden aparecer en otras partes de los ARNm. El ARNm de los virus de la familia Dicistroviridae posee dos marcos de lectura abiertos (ORFs), y la traducción de cada uno está dirigida por un IRES distinto. También se ha sugerido que algunos ARNm celulares de mamíferos también tienen IRESs, aunque esto ha sido un tema de controversia. [4] [5] Varios de estos elementos IRES celulares se encuentran dentro de ARNm que codifican proteínas involucradas en la supervivencia al estrés y otros procesos críticos para la supervivencia. A partir de septiembre de 2009, hay 60 virus animales y 8 virus vegetales informados que contienen elementos IRES y 115 secuencias de ARNm que también los contienen. [6]
Los virus suelen utilizar los IRES como un medio para garantizar que la traducción viral esté activa cuando se inhibe la traducción del hospedador. Estos mecanismos de inhibición de la traducción del hospedador son variados y pueden ser iniciados tanto por el virus como por el hospedador, dependiendo del tipo de virus. Sin embargo, en el caso de la mayoría de los picornavirus, como el poliovirus , esto se logra mediante la escisión proteolítica viral de eIF4G para que no pueda interactuar con la proteína de unión de la tapa 5 ' eIF4E . La interacción entre estos dos factores de iniciación eucariotas (eIF) del complejo eIF4F es necesaria para el reclutamiento de la subunidad ribosomal 40S al extremo 5' de los ARNm, lo que se cree que ocurre además con la formación del bucle de cola de poli(A) 3' de la tapa 5' del ARNm . El virus incluso puede utilizar eIF4G parcialmente escindido para ayudar en la iniciación de la traducción mediada por IRES.
Las células también pueden utilizar los IRES para aumentar la traducción de ciertas proteínas durante la mitosis y la muerte celular programada . En la mitosis, la célula desfosforila eIF4E de modo que tenga poca afinidad por la tapa 5' . Como resultado, la subunidad ribosómica 40S y la maquinaria de traducción se desvían hacia IRES dentro del ARNm. Muchas proteínas involucradas en la mitosis están codificadas por el ARNm de IRES. En la muerte celular programada, la escisión de eIF-4G, como la que realizan los virus, disminuye la traducción. La falta de proteínas esenciales contribuye a la muerte de la célula, al igual que la traducción de las secuencias de ARNm de IRES que codifican proteínas involucradas en el control de la muerte celular. [7]
Hasta la fecha, el mecanismo de la función IRES viral está mejor caracterizado que el mecanismo de la función IRES celular, [8] que todavía es un tema de debate. Los IRES similares al VHC se unen directamente a la subunidad ribosómica 40S para posicionar sus codones iniciadores ubicados en el sitio P ribosómico sin escaneo de ARNm. Estos IRES todavía utilizan los factores de iniciación eucariotas (eIF) eIF2 , eIF3 , eIF5 y eIF5B , pero no requieren los factores eIF1 , eIF1A y el complejo eIF4F . Por el contrario, los IRES de picornavirus no se unen directamente a la subunidad 40S, sino que se reclutan a través del sitio de unión eIF4G . [9] Muchos IRES virales (e IRES celulares) requieren proteínas adicionales para mediar su función, conocidas como factores transactuantes IRES (ITAF). El papel de los ITAF en la función IRES todavía está bajo investigación.
La prueba de secuencias para la función potencial de IRES generalmente se ha basado en el uso de ensayos de reporteros bicistrónicos . En estas pruebas, un segmento candidato de IRES se introduce en un plásmido entre dos cistrones que codifican dos proteínas reporteras diferentes. Un promotor aguas arriba del primer cistrón impulsa la transcripción de ambos cistrones en un solo ARNm. Las células se transfectan con el plásmido y posteriormente se realizan ensayos para cuantificar la expresión de los dos reporteros en las células. Un aumento en la proporción de expresión del reportero aguas abajo en relación con el reportero aguas arriba se toma como evidencia de la actividad de IRES en la secuencia de prueba. Sin embargo, sin la caracterización de las especies de ARNm producidas a partir de dichos plásmidos, no se pueden descartar otras explicaciones para el aumento de esta proporción. [4] [5] Por ejemplo, hay múltiples casos conocidos de elementos IRES sospechosos que luego se informó que tenían función promotora . También se ha demostrado que la actividad de empalme inesperada dentro de varios elementos IRES informados es responsable de la función IRES aparente observada en pruebas de reporteros bicistrónicos. [10] Un promotor o aceptor de empalme dentro de una secuencia de prueba puede dar como resultado la producción de ARNm monocistrónico a partir del cual el cistrón corriente abajo se traduce por iniciación dependiente de cap convencional, en lugar de mediada por IRES. Un estudio posterior que documentó una variedad de especies de ARNm aberrantes inesperadas que surgen de plásmidos reporteros reveló que los sitios aceptores de empalme pueden imitar tanto a los elementos IRES como a los promotores en pruebas que emplean dichos plásmidos, lo que destaca aún más la necesidad de tener precaución en la interpretación de los resultados del ensayo de reporteros en ausencia de un análisis cuidadoso del ARN. [11]
Las secuencias IRES se utilizan a menudo en biología molecular para coexpresar múltiples genes bajo el control del mismo promotor, imitando así un ARNm policistrónico. En las últimas décadas, las secuencias IRES se han utilizado para desarrollar cientos de modelos animales de roedores modificados genéticamente. [12] La ventaja de esta técnica es que mejora el manejo molecular. El problema de las secuencias IRES es que disminuye la expresión de cada gen subsiguiente. [13]
Otro elemento viral para establecer el ARNm policistrónico en eucariotas son los péptidos 2A . En este caso, la posible disminución de la expresión génica y el grado de separación incompleta de las proteínas depende del contexto. [14]