Un sitio de entrada interno al ribosoma , abreviado IRES , es un elemento de ARN que permite el inicio de la traducción de manera independiente de la tapa, como parte del proceso mayor de síntesis de proteínas . El inicio de la traducción eucariota casi siempre ocurre y depende de la tapa 5' de las moléculas de ARNm, donde se forma el complejo de iniciación de la traducción y los ribosomas se unen al ARNm. Sin embargo, los elementos IRES permiten que los ribosomas se unan al ARNm y comiencen la traducción independientemente de la tapa 5'.
Las secuencias IRES se descubrieron por primera vez en 1988 en los genomas de ARN del poliovirus (PV) y del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) en los laboratorios de Nahum Sonenberg [1] y Eckard Wimmer , [2] respectivamente. Se describen como regiones distintas de moléculas de ARN que pueden reclutar el ribosoma eucariota al ARNm. Este proceso también se conoce como traducción independiente del límite máximo. Se ha demostrado que los elementos IRES tienen una estructura secundaria o incluso terciaria distinta, pero hasta la fecha no se han informado características estructurales similares en los niveles de estructura primaria o secundaria que sean comunes a todos los segmentos IRES.
El uso de secuencias IRES en biología molecular pronto se volvió común como herramienta para expresar múltiples genes a partir de una única unidad transcripcional en un vector genético . En dichos vectores, la traducción del primer cistrón se inicia en la tapa 5', y la traducción de cualquier cistrón aguas abajo se habilita mediante un elemento IRES añadido en su extremo 5'. [3]
Los elementos IRES se encuentran con mayor frecuencia en la región 5' no traducida , pero también pueden aparecer en otras partes de los ARNm. El ARNm de los virus de la familia Dicistroviridae posee dos marcos de lectura abiertos (ORF) y la traducción de cada uno está dirigida por un IRES distinto. También se ha sugerido que algunos ARNm de células de mamíferos también tienen IRES, aunque esto ha sido motivo de controversia. [4] [5] Varios de estos elementos celulares IRES se encuentran dentro de ARNm que codifican proteínas involucradas en la supervivencia al estrés y otros procesos críticos para la supervivencia. En septiembre de 2009, se informó que 60 virus animales y 8 virus vegetales contienen elementos IRES y 115 secuencias de ARNm que también los contienen. [6]
Los virus suelen utilizar los IRES como un medio para garantizar que la traducción viral esté activa cuando se inhibe la traducción del huésped. Estos mecanismos de inhibición de la traducción del huésped son variados y pueden ser iniciados tanto por el virus como por el huésped, según el tipo de virus. Sin embargo, en el caso de la mayoría de los picornavirus, como el poliovirus , esto se logra mediante escisión proteolítica viral de eIF4G para que no pueda interactuar con la proteína de unión 5'cap eIF4E . La interacción entre estos dos factores de iniciación eucariotas (eIF) del complejo eIF4F es necesaria para el reclutamiento de la subunidad ribosomal 40S en el extremo 5' de los ARNm, lo que además se cree que ocurre con la formación del bucle de cola poli(A) de la tapa 5' del ARNm a 3'. . El virus puede incluso utilizar eIF4G parcialmente escindido para ayudar en el inicio de la traducción mediada por IRES.
Las células también pueden utilizar IRES para aumentar la traducción de ciertas proteínas durante la mitosis y la muerte celular programada . En la mitosis, la célula desfosforila eIF4E por lo que tiene poca afinidad por la tapa 5' . Como resultado, la subunidad ribosómica 40S y la maquinaria de traducción se desvían hacia IRES dentro del ARNm. Muchas proteínas implicadas en la mitosis están codificadas por el ARNm de IRES. En la muerte celular programada, la escisión de eIF-4G, como la que realizan los virus, disminuye la traducción. La falta de proteínas esenciales contribuye a la muerte de la célula, al igual que la traducción de las secuencias de ARNm de IRES que codifican proteínas implicadas en el control de la muerte celular. [7]
Hasta la fecha, el mecanismo de la función del IRES viral está mejor caracterizado que el mecanismo de la función del IRES celular, [8] lo cual sigue siendo un tema de debate. Los IRES similares al VHC se unen directamente a la subunidad ribosómica 40S para posicionar sus codones iniciadores que se encuentran en el sitio P ribosómico sin exploración de ARNm. Estos IRES todavía utilizan los factores de iniciación eucariotas (eIF) eIF2 , eIF3 , eIF5 y eIF5B , pero no requieren los factores eIF1 , eIF1A y el complejo eIF4F . Por el contrario, los IRES de picornavirus no se unen directamente a la subunidad 40S, sino que se reclutan a través del sitio de unión eIF4G . [9] Muchos IRES virales (e IRES celulares) requieren proteínas adicionales para mediar en su función, conocidas como factores de acción trans (ITAF) de IRES. El papel de los ITAF en la función IRES aún está bajo investigación.
Las pruebas de secuencias para determinar la función potencial de IRES se han basado generalmente en el uso de ensayos de indicadores bicistrónicos . En estas pruebas, se introduce un segmento IRES candidato en un plásmido entre dos cistrones que codifican dos proteínas informadoras diferentes. Un promotor aguas arriba del primer cistrón dirige la transcripción de ambos cistrones en un único ARNm. Las células se transfectan con el plásmido y posteriormente se realizan ensayos para cuantificar la expresión de los dos indicadores en las células. Un aumento en la proporción de expresión del informador descendente con respecto al informador ascendente se toma como evidencia de actividad IRES en la secuencia de prueba. Sin embargo, sin una caracterización de las especies de ARNm producidas a partir de dichos plásmidos, no se pueden descartar otras explicaciones para el aumento de esta proporción. [4] [5] Por ejemplo, hay múltiples casos conocidos de elementos IRES sospechosos que luego se informó que tenían función promotora . También se ha demostrado que la actividad de empalme inesperada dentro de varios elementos IRES informados es responsable de la función IRES aparente observada en las pruebas de reportero bicistrónico. [10] Un promotor o aceptor de empalme dentro de una secuencia de prueba puede dar como resultado la producción de ARNm monocistrónico a partir del cual el cistrón aguas abajo se traduce mediante iniciación convencional dependiente de cap, en lugar de mediada por IRES. Un estudio posterior que documentó una variedad de especies de ARNm aberrantes inesperadas que surgen de plásmidos indicadores reveló que los sitios aceptores de empalme pueden imitar tanto el IRES como los elementos promotores en pruebas que emplean dichos plásmidos, destacando aún más la necesidad de tener precaución en la interpretación de los resultados del ensayo indicador en ausencia de un cuidadoso análisis de ARN. [11]
Las secuencias IRES se utilizan a menudo en biología molecular para coexpresar múltiples genes bajo el control del mismo promotor, imitando así un ARNm policistrónico. En las últimas décadas, las secuencias IRES se han utilizado para desarrollar cientos de modelos animales de roedores modificados genéticamente. [12] La ventaja de esta técnica es que se mejora el manejo molecular. El problema de IRES es que disminuye la expresión de cada gen posterior. [13]
Otro elemento viral para establecer ARNm policistrónico en eucariotas son los péptidos 2A . Aquí, la posible disminución en la expresión genética y el grado de separación incompleta de proteínas depende del contexto. [14]